过表达OsPGIP基因对甘蓝型油菜生长发育影响

李 师， 李国林， 王 睿， 赵 云

(四川大学生命科学学院 生物资源与环境教育部重点实验室， 四川 成都 610065)

1 引 言

PGIP基因编码多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(Poly galacturonase Inhibiting Protein, PGIP)，蛋白序列中含多个富含亮氨酸重复(Leucine-rich repeat, LRR),属于LRR型蛋白[1]，能够特异性结合并抑制病原真菌分泌的内切多聚半乳糖醛酸酶(endo-Polygalacturonase, endo-PGs)[2]，降低多聚半乳糖醛酸酶对植物细胞壁的降解作用，阻断病原菌对植物的侵染，是作物抗病育种研究中的重要基因资源[3].随着研究的进一步深入，曾有研究指出，过表达PGIP基因不仅能够减弱病原真菌对植物细胞壁的降解作用[4]，同时PGIP基因过表达后还能通过调控体内ABA、SA等激素水平[5]、改变植物细胞壁中的糖类组成、调整细胞壁结构[6-7]，进而增强植株对生物及非生物胁迫的抵抗能力.

1971年Aibersheim和Anderson在蚕豆和西红柿的细胞壁中发现PGIP蛋白[8]，至1994年，Favaronetal.从大豆发芽的种子中分离和纯化PGIP蛋自，并设计特异性引物成功克隆了首个大豆PGIP基因，经克隆测序后发现该基因含有1个942bp的开放阅读框，编码313个氨基酸[9].作为重要的抗性基因资源PGIP基因在模式植物抗病方面的研究较多，早在2003年就有研究指出,拟南芥中的PGIP基因表达受到多种真菌病害诱导[10]，之后Ferrarietal.[11]在拟南芥中反义表达AtPGIP1基因增强了拟南芥对葡萄孢菌的抗性.PGIP基因在经济作物中的研究报道较少，研究发现将水稻PGIP2基因在甘蓝型油菜菌核病抗性株系7-5和易感株系T45中过表达后均能显著提高油菜菌核病抗性，且不影响种子千粒重、含油量[12].截止到目前为止，没有研究系统报道过PGIP基因过表达后对油菜生长发育、结实产生的影响，该方面研究的滞后限制了其在作物育种方面的广泛应用.

本研究着重比较三个PGIP基因过表达油菜株系与野生型油菜在整个生长周期内的各项生理指标的差异，探究PGIP基因过表达后对油菜的生长发育过程、特别是对油菜的经济性状产生的有利、有害影响，为PGIP基因在油菜分子育种方面的应用提供一定的依据.

2 材料与方法

2.1 实验材料

甘蓝型油菜(BrassicanapusL.)wester品种及各OsPGIP基因过表达系T1代.

2.2实验方法

2.2.1 种子常规指标考量 任选新收获未完全烘干的种子在Nikon SMZ18荧光体式显微镜下观察、拍照，并对种子的直径(mm)进行测量统计.鲜种子千粒重用万分之一电子天平测量.近红外光谱分析仪Foss NIRS DS2500分析种子品质.

2.2.2 种子萌发率测定 野生型及各过表达株系任选37颗颗粒饱满种子进行种子萌发试验，于超净工作台台中，将种子完全浸泡于0.1%(体积分数)的次氯酸钠溶液中5 min，之后用ddH2O充分洗涤消过毒的种子5次，以完全去除种子表面残留的次氯酸钠溶液.待消毒完成后，将种子均匀点在用ddH2O完全浸湿的滤纸上于培养皿中进行种子萌发，每隔一天观察种子萌发情况，以芽长达到种子长度一半时为发芽标准，记录发芽种子数，计算每种油菜种子的发芽率.

2.2.3 幼苗生长特性测定 种子表面消毒方法参照2.2.2，三个转基因株系种子先在潮霉素抗性筛选培养基上萌发一天(转基因种子中携带潮霉素抗性标记基因能够顺利萌发，非转基因种子不能萌发)，野生型种子在正常无抗性平板上萌发，将顺利萌发的各种油菜种子移至MS平板中于光照培养箱子中生长3 d，记录各种油菜的根长及下胚轴长度，每种油菜设置三个生物学重复.

2.2.4 花器官形态观察 待各种油菜生长至花期，利用Nikon SMZ18荧光体式显微镜观察各种油菜的花器官发育状况.

2.2.5 RT-PCR鉴定表达量 待油菜两片子叶完全展开时，剪取一片子叶利用天根公司的植物总RNA提取试剂盒(DP432)对各种油菜的总RNA进行提取，之后对提取的总RNA进行纯度和完整地的检测，检测完成后进行反转录获得cDNA.

PCR引物见表1.

表1 RT-PCR引物

程序PCR程序设定：95 ℃ 3 min, 95 ℃ 30 s, 58 ℃ 20 s, 72 ℃ 30 s, 72 ℃ 5 min,循环数30.

2.2.6 抗氧化系统功能测定 分别在苗期、抽薹期及初花期取样测定各种油菜抗氧化系统功能.称取新鲜叶片0.06 g，加600 μL酶提取液，冰浴匀浆后8 000 g 4 ℃离心10 min，取上清置于冰上待测.SOD、POD、CAT、MDA含量及羟自由基清除率测定所需试剂及操作步骤参考购买于苏州科铭生物技术有限公司相应的试剂盒.

SOD酶活力单位定义：在试剂盒既定的黄嘌呤氧化酶藕联反应体系中抑制百分率为50%时，反应体系中的 SOD 酶活力定义为一个酶活力单位(U/mL).

POD酶活力单位定义：每克组织在每毫升反应体系中每分钟 A470变化 0.005为一个酶活力单位.

CAT酶活力单位定义：每克组织每分钟催化 1 μmol H2O2降解定义为一个酶活力单位.

2.2.7 重要农艺性状考察 在组培室种植环境下，待各种油菜生长至种子成熟期，对各种油菜的株高、角果数、角果粒数、有效分枝数以及初花天数等重要农艺性状进行统计分析.

2.2.8 数据处理及分析 基础数据用Excel 2016进行处理，显著性分析采用SPSS25软件，相关绘图用GraphPad Prism7.0绘制.

3 结果与分析

3.1 T1代转基因油菜种子常规指标考量

由图1的结果可知，在0sPGIP2,3,4三个过表达株系中，OE-OsPGIP2株系在种子直径和鲜种子千粒重方面均略低于野生型，分别降低了约10.2%和14.1%，而另外两个过表达株系相比野生型，种子直径还是千粒重均略有增加，千粒重分别增加了16.3%和20.5%，达到显著水平.

图1 T1代转基因种子直径及千粒重Fig.1 Diameter and 1 000 grain weight of T1 generation transgenic seedsThe asterisk represents the significant level relative to the wild type (P<0.05), Bar=1.5 mm

表2结果为测得的种子油酸含量、芥酸含量等指标，从表中的数据我们可以清楚的看出，三个过表达株系与野生型相比，油酸含量分别增加了11.2%、0.2%和11.4%、含油量变化分别为1.98%、-3.73%和0.26%，芥酸含量均发生降低，降低幅度分别达到9.8%、5.7%以及OE-OsPGIP4的46.7%.

表2 T1代种子品质性状

3.2 种子萌发率测定

图2为野生型及三个过表达株系种子的平板萌发实验，从图中可以清楚的看出，在相同的萌发条件下萌发两天，OE-OsPGIP2的萌发率最高，达到94.59%；其次为OE-OsPGIP3,81.08%；接下来是OE-OsPGIP4和野生型，均为78.38%.从种子的萌发实验结果可以看出，PGIP基因过表达不会显著抑制种子的萌发率，转基因油菜种子能够正常萌发.

图2 T1代转基因种子萌发率Fig.2 Germination rate of T1 transgenic seeds

3.3 幼苗生长特性测定

图3为野生型及三个过表达株系幼苗生长情况测定结果，在无任何抗性的MS平板上垂直生长3 d后，统计各种油菜根长及下胚轴长度.转基因油菜的根长分别达到26.88、30.43、32.86 mm，相比野生型29.83 mm,分别增加了-9%、 2%和10%，均未达到显著水平.各种油菜下胚轴的长势相当.

3.4 RT-PCR鉴定表达量

OsPGIP2,3,4基因在油菜中均得到高水平表达，结果如图4所示.

图4 RT-PCRFig.4 Reverse transcription PCR

3.5 花器官形态观察

花苞发育时期，随机选取各种油菜大中小三个花苞进行观察，结果如图所示，在花苞发育早期柱头与花药平齐，柱头微微倾斜，等待授粉.六强花药饱满圆润，发育正常，此时期花丝较短，无法分辨.花苞发育阶段，过表达株系及野生型油菜的柱头与花药发育正常，未见明显差异(图5).

花开放期(花瓣裂开后1～2 d)，随机选取其中的一些花进行了观察发现，此阶段花药、花粉均已发育成熟，花药大且饱满，颜色鲜黄，花粉附着其上，动之即落，能够顺利完成传粉.此阶段的花丝得到充分发育，将花药高高托起，使之更接近柱头，提高传粉、授粉效率.花苞时期的四强花药，在这个阶段也发生了显著的变化，其中的四个花药紧紧围绕在花柱四周，花药饱满，花粉繁多；另外两个花药稍远离花柱，花药出现干瘪现象，其上附着少量花粉，为电典型的四强两弱型花药.通过对四强花药的花丝长度测量发现，相比野生型和OE-OsPGIP2及OE-OsPGIP3两个过表达株系OE-OsPGIP4过表达株系的花丝更长，约增长2%(图5).

图5 花器官形态Fig.5 Flower organ morphology

3.6 抗氧化系统功能测定

图6为对各种油菜抗氧化系统功能的测定结果，从图中我们可以看出不管是油菜生长发育的早期(苗期)、中期(抽薹期)还是发育晚期(初花期)，整体上过表达株系抗氧化系统功能相比野生型均未出现明显缺陷，并且在某些过表达株系中相应的酶活力还出现了略高于野生型酶活力的情况.特别是在发育晚期，过表达株系的抗氧化系统功能发挥更优于野生型的趋势.

3.7 成熟期性状统计

图7A为成熟期各种油菜角果长度及每角果果粒数的表型，图B是对图A的统计结果，过表达OsPGIP基因略微降低了角果长度，降幅分别达到8.9%、6.1%和7.3%，但每角果果粒数基本维持不变，分别为23、24、23和25.C图为单位长度角果果粒数，三个过表达株系的单位长度角果果粒数均高于野生型.

对成熟期各种转基因油菜的株高、单株角果数、单株有效分枝数及开花时间的统计结果如图7D-G所示，三个过表达株系与野生型比较，在单株角果数和有效分枝数方面均未出现显著差异.值得注意的是，相比野生型，三个过表达株系的株高略有增加，OE-OsPGIP2株高增加13.6%，OE-OsPGIP3株高增加13.1%，OE-OsPGIP4株系最高，达到153cm,相比野生型增加了23.1%.首次开花天数，过表达株系均显著低于野生型，野生型开第一朵花需要约70 d，OE-OsPGIP2株系需62.3 d，OE-OsPGIP3株系需63 d，而OE-OsPGIP4株系仅需60 d,均达到显著水平.

图6 抗氧化酶活性Fig.6 Antioxidant enzyme activity(A)POD (B)SOD (C)CAT (D)羟自由基清除率The asterisk represents the significant level relative to the wild type (P<0.05)

图7 重要农艺性状Fig.7 Important Agronomic traits(A)Pod phenotype (B) Pod length and number of seeds per pod (C) Number of pods per unit length (D) Plant height (E) Pod number (F) Effective branch number (G) Days of fist floweringThe asterisk represents the significant level relative to the wild type (P<0.05), Bar=1.5mm

4 讨 论

PGIP基因作为重要的抗病基因资源，对其研究主要集中在模式植物、经济作物抗病、抗逆领域[13]，该基因过表达后对植株生长发育的影响，还未见系统报道.本实验侧重探究PGIP过表达后对油菜生长发育、结实等方面产生的影响，进一步丰富PGIP基因的功能.

外源基因在35S启动子的驱动下，持续进行过量表达，对植株的正常生长发育、结实会产生一定的影响.研究发现SIBR1基因在番茄中过表达后，能够增强体内BR信号调控网络作用，对番茄的株高、产量等农艺性状具有一定的改良作用[14]；此外在甘菊中过表达细胞周期基因CIE2F1，能够显著增强甘菊的株高、花序直径等性状[15];以及在拟南芥中过表达E3泛素连接酶ABRv1能够提高拟南芥干旱耐受能力.但也有研究指出，外源基因的持续、过量表达，会造成生物体内能源物质往某一特定方向大量聚集，对植株的正常生长、发育及结实过程产生不利影响，甚至造成植物不育或死亡[16-17].我们研究结果发现，除了OE-OsPGIP2株系显著降低，另外两个过表达株系油菜的T1代转基因植株种子大小及千粒重相比野生型油菜均有所增加；此外，对三个过表达株系菜籽的品质及发芽率的考察也未见明显劣势.

植物根系是植物与土壤环境进行物质交换的主要通道，植物生发育过程中所需的水分、矿物元素等均通过根部进行吸收[18].同时根系在植物固地、抗逆、信号传导等方面也具有重要作用[19]；下胚轴的正常生长对植物新芽钻出土壤、接受光照意义重大[20]. 在种子生长初期，植物根部生长较下胚轴提前，以保证后期幼苗生长充足的物质获取,植物幼苗的根长及下胚轴的这种动态协调生长过程，对植物后期的正常生长发育具有重要意义[21].本实验通过对无菌条件下生长3 d的各种油菜的根长及下胚轴长度测定发现，各种油菜的根长及下胚轴长度间无显著差异.

花器官形态及功能的正常是保证植物顺利繁殖下一代的前提，对经济作物油菜来说更是如此，花器官发育缺陷将会直接造成菜籽产量降低.通过对各种油菜成熟花器官的观察发现，OsPGIP基因过表达对柱头、花药的发育过程几乎无明显影响，值得注意的是OsPGIP4基因在野生型油菜中过表达后能明显增加花丝的长度(图4d),使得柱头能够有更多的时间“埋藏”于花药及花丝中，一方面能够保证传粉、授粉的效率；另一方面对刚受过粉的柱头也是一种保护机制.图5 单位角果长度果粒数与之相互佐证，这种形态上的改变具有重要的意义，具体机制层面原因有待进一步研究.

植物在自身有氧代谢过程中以及外界逆境胁迫下，体内会产生大量活性氧，这类物质在植物体内如不能及时清除，将会对植物的生长发育产生严重的毒害作用.植物为了维持正常的生长，通过抗氧化酶系统和抗氧化剂对活性氧进行清除[22]，抗氧化酶系统功能正常对植物的生长发育至关重要.通过对苗期、抽薹期及初花期各种油菜SOD、POD、CAT酶活力及羟自由基清除能力的测定，证实PGIP基因过表达后，不会对油菜抗氧化酶系统的功能造成危害，三个过表达株系油菜的抗氧化酶系统中的各种关键酶均保持正常酶活力.

作物的开花天数决定了其收获周期，在生产上具有重要意义，也是重要的育种目标[23].研究发现(图6d),三个过表达株系的开花天数较野生型均有减少，减少天数从7～10 d不等，OE-OsPGIP4株系开花天数最短，仅为60 d，有重要的育种价值. 有研究表明，植物开花时间受到多种因素的影响，如光照周期、温度、营养等环境因素，同时还受到植物体内激素水平及开花调节基因的影响[24]，以及某些化学物质调控[25]，但本实验材料开花时间缩短的具体调控机制有待进一步研究.总结，本研究全面评估了OsPGIP2、3、4基因过表达后对野生型油菜生长发育、结实等全过程产生的影响，为OsPGIP基因在油菜分子育种领域的应用打下了一定的理论基础.