用于检测铝离子的比色荧光探针及细胞成像研究

张凯,李明路,董川,宋胜梅,刘洋

(山西大学 环境科学研究所,化学化工学院,山西 太原 030006)

0 引言

自从1871年Von Bayer首次合成荧光素。由于荧光素水溶性好,荧光量子产率高,摩尔消光系数大等较为优异的性能,已被广泛地作为荧光团用于各种离子的检测和生物成像[1-2]。荧光素主要由氧杂蒽环和苯环两部分组成,由于这两部分独一无二的特点,荧光素常被用作各种目标分子的光学传感[3-4],特别是金属离子,如Hg2+[5]、Al3+[6-9]、Cu2+[10]等。

铝是地壳中含量最多的金属元素,其含量大约为8%,仅次于氧和硅。铝的化合物和我们的生活息息相关,例如食品包装、医药、餐饮器具等[11-12]。然而，摄入过多的铝会导致一系列疾病的发生,例如阿尔兹海默症和肌萎缩性脊髓侧索硬化症等[13-14]。据报道,人平均每天摄入铝的量约为3.0～10.0 mg,另外,人体每周摄入铝的量在人体重的占比大约为7 mg/kg[15-16]。因此,在生物体中定量检测Al3+是非常必要的。在各种检测分析方法中,光学(荧光和比色)探针由于具有灵敏度高、对分析物损伤小和“裸眼”检测等优点而备受关注[10,17]。侯等报道了一种可选择性检测Al3+的比色荧光探针,其探针斯托克斯位移较小(50 nm),另外发射波长处于蓝光区,背景干扰较大,会极大地限制其在生物成像的应用[6]。对该探针的改进需要从斯托克斯位移和波长两方面着手。

本文以荧光素为基体,通过5-硝基水杨醛与二溴荧光素酰肼缩合反应,合成了比色-荧光探针5-硝基水杨醛二溴荧光素腙(NDH),并对其结构进行了表征。通过荧光光谱(荧光法)和紫外光谱(比色法)考察了探针NDH对常见金属离子的响应,发现荧光探针NDH对Al3+具有相对较高的选择性。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Hitachi U-2900紫外-可见分光光度计(日本Shimadzu);Bruker/Tensor-27红外光谱仪(德国公司);VARIAN荧光光度计(美国公司);AVANCE-600 MHz核磁共振谱仪(德国Bruker optics公司);GZX-9246MBE鼓风干燥箱(上海公司);PhS-3C型酸度计(德国Sartorius公司)。

二溴荧光素(C20H10Br2O5,阿拉丁试剂有限公司),水合肼(N2H4·H2O,质量百分数80%,天津市富宇精细化工有限公司),2-羟基-5-硝基苯甲醛(C7H5NO4,上海毕得医药科技有限公司),无水乙醇(体积百分数99.7%,分析纯,天津市北辰方正试剂厂),所有金属离子等其他试剂均为分析纯。实验室用水为二次蒸馏水。

1.2 荧光探针NDH的合成步骤及路线

1.2.1 二溴荧光素酰肼的合成

参考文献[18],将1.0 mL(20.0 mmol)水合肼加入到100 mL三口烧瓶中,然后加入20 mL甲醇溶液,搅拌均匀。另外,将溶解在10.0 mL甲醇溶液中的3.4 g二溴荧光素逐滴加入到三口烧瓶中,接着搅拌加热回流4 h。反应完毕后将其冷却到室温,然后旋蒸并真空干燥,再用甲醇溶液重结晶,干燥后得到粉色固体粉末3.89 g,产率82%。

1.2.2 二溴荧光素衍生物NDH的合成

称取0.019 g(0.01 mmol)二溴荧光素酰肼于100 mL三口烧瓶中,接着加入10 mL无水乙醇,超声大约5 min使其溶解,然后逐滴加入溶有0.007 5 g(0.02 mmol)2-羟基-5-硝基苯甲醛的10 mL无水乙醇溶液,搅拌加热回流4 h,反应完毕后将其冷却到室温,然后旋蒸并真空干燥,再用甲醇溶液重结晶,干燥后得到灰白色固体粉末0.025 g,产率75%(见Scheme 1,照片中A为二溴荧光素酰肼在水中的绿色荧光,照片中B为NDH在水中的黄色荧光)。

方案1 NDH的合成路线

1.3 光谱性质的测定方法

将NDH溶于二次水中,配成1.0×10-3mol/L的储备液,用于离子(Al3+,Ba2+,Ca2+,Hg2+,Co2+,Cu2+,Ni2+,Fe3+,Fe2+,Pb2+,Cd2+,Mn2+,Cr3+,Cr2+)选择性测定。NDH滴定检测Al3+的体系为THF-H2O(9∶1,V/V;pH=7.40)。滴定实验:移取荧光探针NDH的储备液于比色管中,并加入相应体积的金属离子储备液,然后用THF-H2O(9∶1,V/V;pH=7.40)溶液定容,用于光谱的测定。荧光检测的激发和发射狭缝分别是5和10 nm。

1.4 细胞实验

将SMMC-7721细胞培养在含10%的胎牛血清DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)培养基中,置于37℃、5%CO2(V/V)的培养箱中,然后将SMMC-7721细胞接种在培养皿中进行24 h的贴壁生长,并除去未贴壁的细胞。在培养皿中加入5.0 μmol/L的探针NDH培养30 min之后,用PBS缓冲清洗细胞3次,接着进行激光共聚焦成像。最后加入10.0 μmol/L的Al3+培养30 min后进行荧光成像。

2 结果与讨论

2.1 二溴荧光素衍生物NDH的表征

化合物NDH,灰白色固体粉末。1H NMR (600 MHz, DMSO) δ 12.23 (s, 1H), 9.97 (s, 2H), 9.11 (s, 1H), 8.72 (d, J=2.8 Hz, 1H), 8.28 (d, J=9.1 Hz, 1H), 7.99 (d, J=32.5 Hz, 1H), 7.18 (d, J=9.1 Hz, 1H), 7.00 (d, J=9.3 Hz, 1H), 6.68 (d, J=8.8 Hz, 1H), 6.43 (q, J=8.6 Hz, 4H); FT-IR (KBr), σ/cm-1: 3 423(-OH),1 631(-C=N). HRMS (ESI): calcd for C27H16Br2N3O7(NDH+H) 651.935 5, found 651.913 4.

2.2 比色法检测Al3+

首先考察了NDH在THF-H2O(9∶1,V/V)溶液中对不同金属离子的紫外可见吸收光谱的响应。如图1a所示,NDH在可见光区443 nm处有明显的吸收,加入Al3+后,NDH在443 nm的吸收峰消失;而加入其他金属离子后,吸收峰强度及位置几乎保持不变(如图1b)。由图1插图可见,NDH溶液的颜色由黄色变为无色,可以实现裸眼识别进而判断铝离子的存在。

2.3 荧光法检测Al3+

NDH对金属离子的荧光选择性实验如图2a,2d所示,结果表明只有加入Al3+才会引起NDH在600 nm处荧光强度的改变,然而其他金属离子对NDH的荧光强度几乎没有影响(图2b),结果表明,NDH可以作为一种高选择性的荧光-比色探针用于Al3+的检测。另外,检测了不同的溶剂对NDH荧光光谱的影响(图2c),发现在THF中具有相对较长的发射波长。在荧光滴定中(图2e),当激发波长为443 nm时,NDH在600 nm处会出现一个明显的发射峰,随着逐渐增加Al3+的浓度,NDH在600 nm处的荧光发射峰强度逐渐降低。这可能是由于Al3+有一个未填充的3d外壳,可以通过电子转移猝灭荧光[19-20];NDH对Al3+的猝灭现象是由于配体金属电荷转移(LMCT),即通过与金属的络合作用,荧光团到Al3+的电子转移[21-22]。由图2e中插图可知,线性回归方程为F0-F=-13.55+54.38[Al3+] (R2=0.981 5,n=14),检测限LOD为0.01 μmol/L(信噪比为3∶1),线性范围为0.2～5 μmol/L。另外,与其他荧光素检测Al3+相比(见表1),结果表示本探针的检测限相对较低,可以作为比色-荧光双渠道探针检测Al3+。如图2f所示,根据Benesi-Hildebrand方程,NDH与Al3+的结合常数为Kd为2.54×105L/mol,这种较高的结合常数表明NDH在溶液中与Al3+有强的键合吸附能力。

2.4 时间响应

NDH+Al3+的时间响应如图3所示,当向NDH(5.0 μmol/L)中加入Al3+(5.0 μmol/L)后,NDH的荧光强度在10 s内达到最低值,10 s以后荧光强度基本保持稳定,而且NDH的荧光强度在10 min内基本保持不变,表明NDH与Al3+的结合可以很快达到平衡。

表1 探针NDH与现有Al3+荧光探针的比较

图1 不同金属离子对NDH(10-5 mol/L)紫外可见吸收光谱的影响

图2 (a)不同金属离子(5.0 μmol/L)对NDH(5.0 μmol/L)荧光光谱的影响;(b)不同金属离子对NDH荧光光谱影响的柱状图;(c)不同溶剂对NDH荧光光谱的影响;(d)Ag+对NDH(5.0 μmol/L)荧光光谱的影响;(e)Al3+(0.2～5.0 μmol/L)浓度对探针NDH(5.0 μmol/L)荧光光谱的影响;(f)NDH与Al3+结合常数的测定

2.5 NDH与Al3+的结合模式

利用等摩尔连续变化法来测定NDH与Al3+的结合比。保持NDH和Al3+的浓度和为1.0×10-5,改变NDH和Al3+的相对浓度比(9∶1,8∶2,7∶3,…,1∶9),通过紫外吸收光谱,测定了不同比例的溶液在424 nm处的吸光度值,以Al3+在二者总浓度中的占比为横坐标,424 nm处的吸光度值为纵坐标,得到Job’s plot工作曲线,如图4所示。结果表明NDH与Al3+形成1∶1结合物。另外,从质谱分析结果也能得出相同结论。如图5所示,峰值m/z 677.909 8为NDH+Al3+[calcd, m/z:677.902 8]。

2.6 细胞实验

首先选用SMMC-7721细胞为模型,如图6a所示,通过MTT实验考察了NDH的细胞毒性。当NDH的浓度为40.0μmol/L时,培养12h后,细胞的存活率仍有90%以上;当NDH的浓度为60.0 μmol/L时,培养12 h后,细胞的存活率仍有80%以上,说明探针具有较低的毒性。在细胞中加入5.0 μmol/L的NDH,然后培养30 min之后,细胞中呈现黄色荧光(如图6b,依次为明场图、暗场图、叠加图);之后加入10 μmol/L的Al3+,细胞的黄色荧光逐渐猝灭(如图6c,依次为明场图、暗场图、叠加图)。

图3 加入Al3+前后NDH的时间响应

图4 NDH与Al3+结合比的测定

图5 NDH+Al3+的质谱图

图6 (a)NDH的细胞毒性;(b)和(c)：NDH和NDH与Al3+细胞成像研究

3 结论

本文以5-硝基水杨醛与二溴荧光素酰肼为原料,合成了新型荧光探针5-硝基水杨醛二溴荧光素腙(NDH),并对其结构进行了表征。随着Al3+浓度的增加,NDH在600 nm处的荧光减弱,基于NDH和Al3+的络合作用,可以实现对Al3+的选择性检测。通过等摩尔变化法,表明NDH与铝离子形成1∶1络合物,并且可以裸眼识别颜色的变化。所制备的探针NDH合成方法简单、选择性好、灵敏度高,可以实现细胞内Al3+的荧光成像。与已报道的探针相比,NDH属于比色-荧光双渠道探针,具有潜在的应用价值。