一株晚花和镉敏感拟南芥突变体的分离与鉴定

张林林,金竹萍,张丽萍,张娇,张晓峰,裴雁曦

(山西大学 生命科学学院,特色植物资源研究与利用山西省重点实验室,山西 太原 030006)

0 引言

镉(Cd)是最具毒性的重金属之一,可以通过食物链危害人类健康。近年来,重金属(尤其是Cd)对拟南芥的毒性作用引起了极大的关注。Cd对植物造成的危害包括根的生长减慢、光合作用降低、氧化损伤加剧,以及产生遗传毒性等,甚至致使植物死亡[1]。相应地,植物体也采取多种应对策略来抵御Cd造成的伤害,如增加Cd向液泡中的转运和区室化,以及合成植物螯合肽(PC)、金属硫蛋白(MT)等[2-4]。植物耐受Cd的分子机制包括阻止根系对Cd的吸收、液泡膜内向转运减少Cd的毒害以及螯合作用对Cd的解毒[5-7]。利用植物突变体可以更加深入地研究植物对镉胁迫的响应机制。Howden[8]和Cobbett[9]最早获得了拟南芥Cd敏感突变体cad1和cad2,从而利用Cd敏感突变体鉴定了一些可以催化PC合成的酶,更好地表征了植物螯合素表达对重金属耐受性的重要作用。但是,除了这些具有开创性的研究,鲜有其他Cd敏感拟南芥突变体的研究报道。

在拟南芥中,开花时间是信号通路复杂网络调控的结果[10]。该网络包括4个主要的经典途径:春化途径、光周期途径、自主途径和赤霉素途径。自主途径和春化途径的基因通过开花抑制子Floweringlocusc(FLC)调节开花,而光周期和GA途径的基因则通过FloweringlocusT(FT)调节开花期[11]。FLC的高表达通常会导致晚开花表型,而FLC可以通过直接结合的方式抑制花诱导剂FT和Suppressorofoverexpressionofco1(SOCI)基因启动子CArG-box来调节其表达[12]。

HOS1可以同时调节冷适应和春化作用的关键基因[13]。通过Northern分析确定hos1突变体中FLC的表达发生了改变[14]。在拟南芥中过表达HOS1基因可降低CBF(c-repeatbindingfactor)基因的表达,即HOS1是CBF的负调控因子[15]。HOS1敲除突变体hos1开花较早,而且CBFs及其下游基因在hos1突变体中表达也明显增强。CBFs常与DREB(DREBindingprotein)互作发挥作用,DREB基因过量表达可使植株对氧化胁迫的耐受性增强[16-17]。CBF/DREB基因可用于提高重要农作物对氧化胁迫耐受性。然而,35S CaMV启动子启动CBF/DREB的过度表达会使植株生长发育明显迟缓[18]。使用胁迫诱导型rd29A启动子代替组成型35S CaMV启动子来启动CBF/DREB过表达,可以最小化过量表达对植物生长的负面影响[19-20]。由此可见HOS1及其下游基因CBF/DREB参与氧化胁迫响应,而Cd胁迫对植物体的损害主要通过对植物细胞产生氧化损伤所致,因此我们猜想HOS1可能会参与植物体的Cd胁迫响应。

本文通过筛选和鉴定,获得了具有晚开花和Cd敏感表型的fcr(FLC-dependent late-flowering and Cd-sensitive mutant)突变体,并分析了其作用途径。

1 材料与方法

1.1 植物材料和生长条件

使用了哥伦比亚拟南芥种子(Col-0)和化学诱导型拟南芥XVE诱导型激活突变体种子(中国科学院遗传与发育生物学研究所的左建儒教授提供)。植株的生长条件和其他相关方法描述详见参考文献[21]。

1.2 Cd处理

用体积分数70%乙醇消毒10 s,之后用含有0.05% (V/V)Tween-20的50 g/L氯酸钠(Nacalai Tesque,Kyoto,Japan)消毒10 min,对拟南芥种子表面进行灭菌。蒸馏水洗涤3次后,将种子(每组50粒)播种到在含有质量分数1%蔗糖的10 mL 1/2 Murashige-Skoog(MS)培养基上,在长日照条件下于 23℃、60% 相对湿度、16/8 h(光/暗)以及 160 μEmm-2 s-1 光照强度的温室中培养。为了确定Cd毒性对实验材料的影响,将种子播种于含0、50、80、90、100和150 μmol/L CdCl2的1/2MS培养基中生长。10 d后,测量根长。每个值代表3次重复的平均值±SD。通过Duncan检验进行单因素方差分析(P<0.05)确定显著性。

1.3 GA处理

植株移植到土壤中后,长日照条件下每3 d用1 mmol/L GA3或水(对照)喷洒一次直到抽薹[21]。

1.4 T-DNA插入分析

使用热不对称交错聚合酶链反应(TAIL-PCR)对T-DNA插入位点进行分析。TAIL-PCR中使用的引物如下[22]:

LexA3

5′-ATCATCCC CTCGACGTACTGTAC-3′

LexA4

5′-CTGGTTTTATATACAGCAGTCACG-3′

LexA5

5′-AGTCGAGGTAAGATTAGATATGG-3′

LexA6

5′-TTGG AGAGGACACGCTG AAGC-3′

AD1

5′-NTCGA (G/C) T (A/T) T (G/C) G(A/T) GTT-3′

AD2

5′-NGTC GA (G/C) (A/T) GANA (A/T)GAA-3′

AD3

5′-(A/T) GT GNAG (A/T) ANCANAGA-3′

AD4

5′-NGTA (G/C) A (G/C) (A/T) GTNA(A/T) CAA-3′

1.5 总RNA提取和RT-PCR

植株总RNA提取和RT-PCR实验方法见文献[21]。以cDNA为模板进行RT-PCR,PCR条件为预变性94℃ 1 min;94℃ 30 s,58℃ 30 s和72℃ 2 min,重复25个循环;72℃ 5 min。At1g35820,At1g35830和At1g35840的引物如下:

At1g35820

5′-TATGAAAGGTAAAG GAGGAC-3′

5′-ACAATCCCTTGCCTTC-3′

At1g35830

5′-CAAACTCCGAGAACTGCCTCA-3′

5′-GGGTCAGTTCGAGCTTAGTGG-3′

At1g35840

5′-CCTCTTCTTCCCGAAACCCTA-3′

5′-GTGCGGTCCTTGTCAGTGTC T-3′

图1 不同浓度CdCl2对拟南芥Col-0根长的影响

2 结果

2.1 Cd阻碍拟南芥的生长

为了验证Cd对拟南芥植株中的毒性,进行Cd剂量效应实验。Col-0种子萌发后移至含有不同浓度CdCl2的1/2 MS中生长10 d，结果见图1。CdCl2处理后植株的生长状态明显比对照差(P<0.05)。

Cd胁迫可延缓根的生长并诱导叶的褪绿病(图1B),根生长随培养基中Cd浓度的增加而显著减缓(图1A)。在90 μmol/L CdCl2下,植株生长部分受阻,但仍可观察到生长。因此选择含90 μmol/L CdCl2作为Cd的处理浓度。

图2 fcr突变体的表型及其T-DNA插入位点

2.2 突变体筛选及fcr突变体的表型

为了筛选获得Cd敏感突变体,将化学诱导型拟南芥突变体种子种于含有90 μmol/L CdCl2的1/2 MS中生长10 d,然后将植物移植到含有土壤:珍珠岩:蛭石(1/1/1,V/V/V)的土培基质中以观察表型。

在90 μmol/L CdCl2下,fcr突变体的生长受到完全抑制。fcr突变体和Col-0植株的根生长差异见图2A。在长日照条件下,fcr突变体生长16周仍没有开花(图2B)。与Col-0相比,fcr突变体明显晚花(图2C)。为了进一步探索fcr影响开花的途径,用GA3处理了fcr,可以看出GA3部分恢复了fcr的晚花表型(图2D)，这表明fcr影响开花时间可能与GA途径相关。

2.3 T-DNA侧翼序列分析

通过TAIL-PCR扩增T-DNA侧翼序列,并在TAIR数据库中进行BLAST发现,突变体fcr的T-DNA插入在At1g35820和At1g35830之间(图2E)。通过RT-PCR检测T-DNA插入片段附近基因At1g35820,At1g35830和At1g35840的表达模式。无论是否经过春化,它们的转录水平表达在Col-0和fcr突变体中没有明显差异(图3A)。

图3 相关基因在野生型和fcr突变体中表达量的比较

2.4 开花期fcr的分子特征

为了研究突变体的极端晚花表型,通过RT-PCR比较了Col-0和fcr中开花时间相关基因的表达模式。在fcr中FLC的表达水平显著高于Col-0,而且FLC的关键靶基因SOCI的表达也显著降低(图3B)。

自主途径中的基因FRI,FRL1,FRL2,VIP3,VIP4,ART1,PIE和ESD4与FLCmRNA的丰度协同下调,而FCA,FY,FLD,FVE,FPA,LD,FLK和REF6可以上调FLCmRNA的表达量。因此,分析了这些基因在Col-0和fcr中的表达。结果显示,所有基因均没有在Col-0和fcr中检测到转录水平表达差异(图3C)。

2.5 fcr响应Cd胁迫的分子机制

植物响应Cd的信号途径尚不清楚。为了验证fcr的Cd敏感表型,对Cd胁迫下fcr突变体相关分子途径相关基因进行了检测。通过RT-PCR检测应激相关基因CBF3的表达模式,发现该突变体CBF3表达量降低并且突变体中Cd耐受性比Col-0差(图3D)。在fcr中,HOS1(CBF3的关键上游抑制剂)的表达也显著增加(图3D)。

3 讨论

重金属可能对动植物产生毒害。然而植物如何识别和抵御重金属毒性的潜在分子机制尚未全部发掘[22]。通过对Cd敏感突变体的研究发现,植物可通过多种分子机制来应对重金属胁迫[23]，但很少有Cd敏感的拟南芥突变体报道。本研究通过筛选对Cd响应的拟南芥突变体,获得了一个突变体,表现出Cd敏感表型和晚开花表型。通过分子遗传分析,发现fcr是一个新的Cd敏感的T-DNA插入突变体(图2)。

图4 fcr突变体中调节响应Cd胁迫和开花时间的可能机制

FLC的表达量可用于表征春化途径相关的晚花突变体。fcr中FLC的表达水平显著高于Col-0,而SOCI的表达也随FLC的增加而受抑制(图3),但已知的FLC上游基因的表达未改变。有趣的是,fcr中应激相关基因CBF3的关键上游抑制基因HOS1的表达水平显著高于Col-0。TAIL-PCR结果显示该突变体中的T-DNA插入在At1g35820和At1g35830之间。T-DNA插入导致的Cd敏感和晚花表型可能与HOS1的表达变化有关。

在寒冷适应中,HOS1对冷胁迫响应基因有负调节作用。在hos1突变体中,冷诱导下CBF/DREB转录因子含量增加；即使没有春化处理,hos1突变植物的FLC表达水平也明显较低，这种FLC低水平表达与hos1突变体的早花表型相关[14]。这些结果表明HOS1是春化作用的负调节剂,是FLC高水平表达所必需。

综上所述,HOS1可能参与在fcr突变体响应Cd敏感和晚花途径，但HOS1如何参与Cd响应和开花时间调控这两个途径的潜在分子机制还需要进一步的深入研究来确定。此外,还需要进一步探索fcr的突变位点是如何在分子水平影响开花时间调节和Cd胁迫响应的。