白桦BpbHLH112基因克隆及其启动子表达特性分析

姜 骋 张 曦 田 晴 李 莉

(林木遗传育种国家重点实验室，东北林业大学，哈尔滨 150040)

碱性螺旋—环—螺旋蛋白(Basic helix-loop-helix protein,bHLH)是一类含有众多成员的转录因子家族，广泛存在于动物、植物以及微生物中[1]。bHLH基因家族因包含有bHLH结构域而得名，该结构域由60个左右的保守氨基酸序列组成，包含两个保守但功能不同的结构域，一个是位于N端的碱性氨基酸区，其作用是识别并特异性结合靶基因启动子中的DNA基序，另一个是位于C端的螺旋—环—螺旋区，其主要功能是进行域二聚，促进蛋白—蛋白相互作用，并允许形成同型二聚体或异型二聚体来控制基因转录。bHLH蛋白结构中除了高度保守的bHLH结构域外，其他序列的保守性较差[2]。

近年来的研究发现，植物bHLH基因参与了广泛的生物学过程中，包括光信号调节[3]；激素信号转导[4]；响应高盐、干旱、机械损伤、氧化胁迫[5]、低温胁迫[6]、缺铁反应[7]和类黄酮类物质合成[8]等。目前通过大量的研究已经发现了许多响应逆境胁迫的bHLH转录因子。例如Liu等研究发现，过表达bHLH122增强了转基因拟南芥对干旱、高盐以及渗透压的抵抗力，同时bHLH122可以直接调控参与抗逆响应的基因的转录表达，表明bHLH122是一个干旱及其他逆境信号通路的转录激活子[9]。水稻OsbHLH148和RERJ1(OsbHLH006)基因能够通过茉莉酸信号途径参与干旱胁迫和损伤反应的应答[10～11]。小麦的TabHLH39在拟南芥中过表达后，增强了转基因植株对盐害、干旱及氧化作用的耐受性[12]。Jin等报道，秋子梨PubHLH1基因能够增强转基因植株对冷害的抵抗性，并且激活了逆境应答基因的转录表达[6]。

白桦(BetulaplatyphyllaSuk.)是我国东北地区具有重要应用价值的树种之一。本课题组前期对高盐、干旱胁迫下白桦基因的转录组进行了分析，获得了逆境胁迫诱导下基因的表达信息,根据高盐、干旱不同胁迫时间下基因表达量比较分析的结果，选出一个差异表达显著的bHLH基因，命名为BpbHLH112。为了进一步研究该基因调控白桦应答逆境胁迫响应的功能，本研究克隆了BpbHLH112的编码区序列，对其序列进行了生物信息学分析，并对盐和干旱胁迫下BpbHLH112的表达模式进行了分析，进一步克隆获得BpbHLH112基因启动子序列。顺式作用元件预测分析结果表明，该区域包含多个逆境响应和激素响应等顺式作用元件,因而构建了BpbHLH112启动子片段融合GUS报告基因的表达载体,采用烟草中瞬时表达的方法对该启动子在正常条件和胁迫条件下的GUS基因表达的特性进行了比较分析，本研究结果为深入研究BpbHLH112基因调控白桦应对非生物胁迫作用的分子机理提供了依据，具有重要的理论意义。

1 材料与方法

1.1 实验材料

白桦无性系组培苗由本课题组保存。将组培生根苗移栽到黑土∶蛭石∶珍珠岩=5∶3∶2的基质中培养8周，选取株高和长势一致的幼苗，分别进行200 mmol·L-1NaCl、18%(w/v)PEG6000浇灌处理，处理时间为0、6、12、24、48、72 h，每个时间点均设3个生物学重复。分别剪取处理后植株的根组织，液氮速冻后保存于-80℃，用于总RNA的提取。

1.2 白桦BpbHLH112基因及其启动子的克隆

参照“植物RNA提取试剂盒”(BioTeke)的操作流程，提取白桦叶片和根组织的总RNA，采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TakaRa)反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA。在BpbHLH112基因开放阅读框两端设计基因上游引物(5′-ATGGCAGAGGAATTTCAGGC-3′)和下游引物(5′-CCTGAATGTTCCCCCAAATG-3′)，以白桦cDNA为模板，扩增白桦BpbHLH112基因全长编码序列(ORF)，使用DNA凝胶回收试剂盒、PCR产物，然后克隆到pMD18-T载体上，并转入到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，挑取单克隆扩大培养后进行测序验证。

根据“新型快速植物基因组DNA提取试剂盒”(BioTeke)说明书，以白桦无性系叶片为材料提取基因组DNA，根据序列比对分析结果，在BpbHLH112基因启动子区的两端设计上游引物bHPro-F(5′-CGAGCTCCTGATGGCGATTTTTGTGACT-3′)和下游引物bHPro-R(5′-AGATCTATGTAGCCATCCACCAGTTT-3′)，以白桦DNA为模板，扩增BpbHLH112基因启动子片段，PCR产物胶回收纯化后与克隆载体pMD18-T连接，命名为pMD18-T-BpbHLH112pro，连接产物转化大肠杆菌DH5α中，PCR验证阳性克隆进行测序。

1.3 白桦BpbHLH112基因及启动子序列的生物信息学分析

利用在线软件ExPASy的ProtParam tool(http://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/)程序分析BpbHLH112编码蛋白的相对分子量、等电点等理化性质，使用在线网站http://smart.emblheidelberg.de进行保守结构域的预测。通过NCBI中的BLASTP(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp)获取其同源蛋白的氨基酸序列，利用DNAMAN进行多序列比对，采用MEGA5.1软件中邻位相连法(Neighbor-joining)构建系统进化树。

运用在线分析工具PSORT Prediction(http://psort1.hgc.jp/form.html)对BpbHLH112基因进行亚细胞定位预测分析。

使用New PLACE[13](http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)和Plant CARE[14](http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)数据库预测BpbHLH112基因启动子的主要顺式作用元件。

1.4 高盐和干旱胁迫下白桦BpbHLH112基因的表达模式分析

采用软件Primer 5设计实时荧光定量PCR上游引物(5′-CGGTCTCCGATCAGAACTCC-3′)和下游引物(5′-TTGCTCTCACCTCTCCCACT-3′)。实时荧光定量PCR反应体系按照TaKaRa公司的SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒使用说明。PCR反应条件为95℃预变性30 s；95℃变性5 s，60℃退火30 s，40个循环。以白桦Tubulin基因(GenBank number：FG067376)作为内参，其扩增引物为5′-TCAACCGCCTTGTCTCTCTCAGG-3′和5′-TGGCTCGAATGCACTGTTGG-3′，每个样品重复3次，用2-ΔΔCt法进行基因的相对表达量分析。

1.5 白桦BpbHLH112基因启动子融合GUS基因表达载体构建

根据pCAMBIA1301载体和BpbHLH112基因启动子序列的融合特性，结合ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit(Vazyme)的使用说明，设计带限制性内切酶XbaⅠ和BglⅡ酶切位点的启动子上下游引物(见表1)，其中p1301-GUS-F和p1301-GUS-R为pCAMBIA1301载体序列引物，用于验证目的片段是否连接到载体上。

表1BpbHLH112启动子片段与GUS基因融合所用引物序列

Table 1 A list of primers used to construct theBpbHLH112 promoter:GUS expression vector

注：‘—’为线性化载体两末端同源序列；‘=’为用于载体线性化的酶切位点

Note:‘—’the labeled nucleotides were the homologous sequences to vector;‘=’ nucleotides underlined were used for producingXbaⅠ andBglⅡ restriction site

以携带有BpbHLH112启动子片段的pMD18-T-BpbHLH112pro质粒为模板进行PCR扩增，产物经胶回收和双酶切验证，同时以pCAMBIA1301空载体为对象，用XbaⅠ和BglⅡ进行双酶切，经电泳检测后回收较大载体片段。将启动子片段BpbHLH112pro与去除了CaMV35S启动子的pCAMBIA1301载体片段进行无缝连接，使BpbHLH112启动子片段代替pCAMBIA1301载体中的CaMV35S启动子，并与GUS报告基因融合。

1.6 农杆菌介导的烟草瞬时转化

农杆菌注射渗透法瞬时转化烟草过程参考Yang等[15]，分别将含有阳性对照、阴性对照和重组载体的质粒转化大肠杆菌DH5α中，把经PCR验证和测序比对正确的转化子导入农杆菌GV3101中，经菌液PCR验证的单菌落扩大培养，用渗透液[10 mmol·L-1MgCl2，10 mmol·L-1MES，150 mmol·L-1AS，pH=5.7]重悬后，注射到6周龄的烟草植株叶片中，浸染后的植株继续培养2 d，用直径为1 cm的叶片打孔器制备烟草叶盘，并进行胁迫处理。

将浸染2 d后的叶盘分为4组，分别用H2O(对照)、200 NaCl mmol·L-1、18% PEG6000及100 mmol·L-1ABA胁迫处理24 h，然后进行GUS染色分析和GUS酶活定量分析。

1.7 GUS活性的组织化学染色分析和定量分析

按照Jefferson[16]等的方法对转基因烟草叶盘进行GUS组织化学染色分析。侵染后的叶盘洗净后置于GUS染色液中，37℃保温过夜，用脱色液脱色，观察染色结果并拍照记录。

称取100 mg胁迫处理后的叶盘加入3倍体积的GUS提取缓冲液[50 mmol·L-1磷酸钠缓冲液,10 mmol·L-1EDTA,0.1% Triton X-100,0.1%(w/v) SDS和0.1% β-巯基乙醇]，研磨成匀浆，离心收集上清。利用TAKARA Bradford protein assay kit测定总蛋白含量，使用Infinie200 PRO多功能酶标仪测定样品的荧光强度。

2 结果与分析

2.1 白桦BpbHLH112基因的克隆与序列分析

利用BpbHLH112基因特异性引物，以白桦根和叶片cDNA为模板，通过PCR扩增获得BpbHLH112基因开放阅读框(ORF)扩增片段(见图1)。根据PCR产物测序结果以及对ORF序列的生物信息学分析表明，白桦BpbHLH112基因ORF序列全长为1 431 bp，编码1个由476个氨基酸残基组成的蛋白质(见图1)。预测分子量为52.05 kD，理论等电点(Theoretical pI)为5.78。该蛋白主要由丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、谷氨酰胺(Gln)等22种氨基酸构成，其中丝氨酸(Ser)的含量最高，占14.7%。脂溶系数(Aliphatic index)为55.92，总平均亲水性平均指数(Grand average of hydropathicity)为-0.593，说明BpbHLH112蛋白是一个亲水性蛋白。不稳定系数(Instability index)分析显示该蛋白不稳定系数为57.80，可能是一个不稳定蛋白。

图2 白桦BpbHLH112与其他物种同源蛋白多序列比对Fig.2 Amino acid sequence alignment of BpbHLH112 and bHLHs from the other plants

图3 白桦BpbHLH112与其他物种同源蛋白系统进化树 分支上的数值表示Bootstrap验证中基于1 000次重复该节点的可信度Fig.3 Phylogentic tree analysis of BpbHLH112 and bHLHs from the other plants The numerical value on the branch indicates the credibility of the node based on 1 000 repetitions in bootstrap verification

利用NCBI上的BLASTP工具，对BpbHLH112进行氨基酸序列同源性的检索，找出与其序列一致性相对较高的来自9个物种的bHLH蛋白序列。多重序列比对分析结果表明(见图2)，白桦BpbHLH112转录因子与其他bHLH转录因子都含有一个高度保守的DNA结构域，对应于白桦bHLH112的349～409位氨基酸残基处，这一保守结构域由60个氨基酸构成，分为两个功能不同的区域：basic区域(碱性氨基酸区)含16个氨基酸，HLH区域含44个氨基酸残基，该区域是具有螺旋环螺旋区域基因家族所特有的bHLH保守结构域。不同植物的bHLH蛋白存在几段长度不等的序列高度保守区域，可以推测这些序列可能是该蛋白的重要功能位点。白桦bHLH112蛋白与栎树(Quercusruber)、欧洲葡萄(Vitisvinifera)、银白杨(Populusalba)的氨基酸序列一致性较高，分别为75%、64%和63%。

利用MEGA5.1将白桦BpbHLH112氨基酸序列与其他物种bHLH序列进行聚类分析，采用最大似然法绘制系统进化树，结果表明白桦BpbHLH112与栎树bHLH同源蛋白的亲缘关系较近(见图3)。

运用在线分析工具PredictNLS预测BpbHLH112蛋白的亚细胞定位，结果表明，BpbHLH112可能定位在细胞核上，预测可信度为92。

图4 盐和干旱胁迫下白桦根中BpbHLH112基因的表达分析Fig.4 Expression analysis of BpbHLH112 under salt and PEG6000 stress

2.2 高盐和干旱胁迫处理下BpbHLH112基因的表达模式分析

为了研究白桦BpbHLH112基因在盐和干旱胁迫处理下的表达模式，分别用200 mmol·L-1NaCl或18% PEG6000胁迫处理2个月大的白桦实生苗，在0、6、12、24、48、72 h分别对各处理的根组织取材，提取RNA反转录成cDNA作模板进行实时RT-PCR，结果如图4所示。

经NaCl处理6～48 h的时间内，白桦BpbHLH112基因的表达呈上调趋势，在处理48 h时达到最高，其表达量高于0 h对照(即未胁迫胁迫)的9倍以上，随着胁迫时间的延长，在72 h时又回落到6 h的水平。在PEG6000处理6～12 h的时间内，白桦BpbHLH112基因的相对表达量没有发生显著变化，在处理24 h后，与0 h对照相比，其表达量呈显著上升趋势，在处理72 h时达到最高，为对照的7倍以上。以上分析表明，白桦BpbHLH112基因能够对盐或干旱胁迫产生应答反应。

2.3 BpbHLH112基因启动子克隆和顺式作用元件预测分析

以白桦DNA为模板，采用上游引物bHPro-F和下游引物bHPro-R，扩增BpbHLH112基因启动子片段，使用1%的琼脂糖凝胶电泳分别进行检测，结果显示其条带大小与目的片段实际大小相一致(见图5A)。将启动子片段与载体pMD18-T的连接片段pMD-18-T-pBpbHLH112pro转化DH5α感受态细胞中，经菌落PCR验证的阳性克隆菌液送测序。测序结果显示，获得的启动子片段与白桦全基因组测序结果中该基因启动子序列的比对完全一致。

使用New PLACE和PlantCARE在线软件分析预测BpbHLH112启动子所含有的顺式作用元件，分析结果显示：BpbHLH112基因启动子区域除了含有TATA-box和CAAT-box等核心元件之外，还包含了一些激素相关元件，如脱落酸应答相关元件ABRELATERD1和ABRERATCAL；赤霉素应答元件GAREAT、MYBGAHV和WRKY71OS；生长素、水杨酸和光响应元件ASF1MOTIFCAMV；水杨酸响应元件WBOXATNPR1等；逆境胁迫响应元件如干旱响应元件MYB1AT和MYBCORE；干旱及低温响应相关元件MYCCONSENSUSAT；盐及病原物响应相关元件GT1GMSCAM4；盐响应、水杨酸及光响应元件GT1CONSENSUS；损伤响应元件WBOXNTERF3；抗病响应相关元件BIHD1OS等，光响应元件如GATABOX、IBOXCORE、INRNTPSADB等。除此之外，BpbHLH112基因启动子还含有多个参与保卫细胞中K+渗入通道基因表达的TAAAGSTKST1元件、Ca2+响应相关顺式元件ABRERATCAL、参与Ca2+/calmodulin信号响应的“CGCG box”、光合作用中碳代谢相关元件DofCOREZM、参与转录激活ARR1AT元件、花粉特异表达的顺式作用元件POLLEN1LELAT52等其他控制植物生长发育的顺式作用元件(见表2)，这表明BpbHLH112基因启动子的活性可能受多种因素的调节。

2.4 BpbHLH112启动子融合GUS报告基因表达载体的构建

以pMD-18-T-pBpbHLH112为模板，并以bHPro-F/bHPro-R为引物进行PCR扩增，使用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果如图4A所示，其条带大小与BpbHLH112基因启动子片段实际大小相一致，胶回收后连接去除35S启动子的pCAMBIA1301载体的骨架片段，转化大肠杆菌DH5α后，提取质粒并用pCAMBIA1301载体引物p1301-GUS-F/1301-GUS-R和启动子扩增片段引物交叉进行PCR验证(见图5B)，证明BpbHLH112基因启动子片段已经连接到pCAMBIA1301载体上，采用液氮冻融法导入农杆菌GV3101感受态细胞中,在含有50 mg·L-1Kana和50 mg·L-1Rif的LB培养基上筛选，经菌落PCR鉴定获得阳性克隆,可用于后续的试验。

图5 BpbHLH112基因启动子融合GUS载体构建 A.BpbHLH112启动子克隆(M. DL2000 DNA Marker；1.BpbHLH112基因启动子全长)；B.BpbHLH112启动子重组质粒检测(M. DL2000 DNA Marker; 1. BpbHLH112启动子引物和pCAMBIA1301载体引物交叉PCR产物)Fig.5 Construction of GUS expression vector fused with BpbHLH112 promoter fragment A.Cloning of the promoter of BpbHLH112 gene(M. DL2000 DNA Marker; 1. Full length of BpbHLH112 promoter); B.Detection of recombinant plasmid of BpbHLH112 promoter(M. DL2000 DNA Marker; 1. PCR product using combined primers derived from vector and BpbHLH112 promoter)

2.5 BpbHLH112启动子驱动GUS报告基因的表达分析

利用注射法将携带有BpbHLH112启动子片段重组质粒的农杆菌浸染烟草叶片，阳性对照为带有CaMV 35S启动子的pCAMBIA1301载体质粒，而去除CaMV 35S启动子的pCAMBIA1301载体质粒作为阴性对照。

GUS组织化学染色分析结果如图6A所示，阴性对照未被染上蓝色，而阳性对照被染成了明显的深蓝色。在实验组中， 转入BpbHLH112启动子片段载体质粒的叶盘在H2O对照处理下染色较浅，而经过NaCl、PEG6000和ABA处理后，浸染后的叶片染色效果明显加深，表明BpbHLH112启动子片段能够响应干旱、盐和ABA胁迫，驱动GUS基因在烟草叶片中的表达。进一步对BpbHLH112启动子片段的转基因烟草叶片在胁迫处理后的GUS酶活性进行测定，结果表明(见图6B)，在盐、干旱和ABA胁迫诱导下，转入BpbHLH112启动子片段的叶盘中GUS酶活性均有显著的变化，分别是H2O对照处理叶盘中GUS酶活性的9.82、12.14和8.09倍。由此可进一步表明，BpbHLH112启动子受干旱、盐及ABA胁迫诱导，属于逆境胁迫诱导型启动子。

表2 白桦BpBHLH112启动子的部分顺式作用元件

注：碱基序列:R=G/A,W=A/T,N=A/T/C/G

Note:Base sequence:R=G/A,W=A/T,N=A/T/C/G

图6 BpbHLH112启动子片段对非生物胁迫响应分析 A.NaCl、PEG6000和ABA胁迫下转基因烟草叶盘GUS组织化学染色分析；B. NaCl、PEG6000和ABA胁迫下转基因烟草GUS酶活分析，所有数据为3次重复Fig.6 Analysis of BpbHLH112 promoter construct in tobacco plants under salt,drought and ABA treatments A. GUS histochemical staining of BpbHLH112 promoter construct in tobacco plants under NaCl,PEG6000 and ABA treatments; B. GUS activity of BpbHLH112 promoter construct in tobacco plants under NaCl,PEG6000 and ABA treatments Values represent the means±SD from three repeats

3 讨论

植物在生长发育的过程中会受到各种不利环境的影响,为了在变化多端的环境中更好地生存,植物会在环境发生变化时调控特定抗逆基因的表达[17]。逆境相关基因的表达在转录水平上的调控是通过启动子中逆境诱导相关的顺式作用元件与反式作用因子的相互作用来实现的[18～19]。本研究基于盐、干旱胁迫下白桦转录组表达谱分析结果，选出白桦BpbHLH112基因，对其表达模式分析表明，BpbHLH112基因能够响应盐和干旱胁迫反应，进一步分析发现，BpbHLH112启动子能够被盐、干旱及ABA胁迫因子激活，驱动下游基因的表达，属于多逆境诱导型启动子。

BpbHLH112启动子活性受干旱诱导，这可能与启动子中含有3个干旱应答相关顺式元件有关。在BpbHLH112启动子中存在有1个MYB1AT基序、6个MYCCONSENSUSAT基序和2个MYBCORE基序。Abe等人分别于1997[20]和2003年[21]证明，拟南芥的干旱响应基因RD22启动子中MYB1AT和MYCCONSENSUSAT元件可以与MYB或bHLH转录因子相结合，在干旱和ABA胁迫下显著增强靶基因的表达。Urao等发现，拟南芥MYB转录因子可以结合MYBCORE元件，调节脱水诱导基因的表达[22]，我们推测BpbHLH112启动子中的干旱应答相关顺式元件对启动子在干旱处理下活性的升高起重要作用。

BpbHLH112启动子活性也受NaCl一定程度的诱导。前人研究发现，许多植物基因的启动子中含有序列保守的GT元件[23]，拟南芥调控因子TFIIA-TBP-TATA可以与GT-1元件结合形成复杂的复合体，调控植物基因的转录过程[24～25]。Park等报道了GT-1-like转录因子可以结合GT-1 box(GT1GMSCAM4)元件，在大豆SCaM-4基因启动子响应病原菌和NaCl诱导的表达调控中起正调控作用[26]。从序列分析结果可知，BpbHLH112启动子中存在有5个GT1GMSCAM4元件，它们可能对BpbHLH112启动子在高盐胁迫下的表达活性提高起到调控作用。这与早前对豌豆PsSEOF1基因[27]和甜瓜CmLOX08[28]基因启动子功能研究的结果相一致。

ABA是重要的植物激素之一，不仅参与多个植物生长发育过程，而且作为胁迫激素参与植物对外界胁迫条件的适应[29]。植物转录因子参与调节干旱、高盐、低温等胁迫信号应答的途径有两种：一种是依赖于ABA的信号转导途径，另一种是不依赖于ABA的信号转导途径[30]。研究表明，转录因子通过结合ABA胁迫相关的顺式作用元件如ABREs、DRE/CRTs或者含有MYB和MYC蛋白结合位点(MYBR和MYCR)等激活植物对逆境的应激反应[31]。本研究发现，在BpbHLH112启动子区域分布有1个ABRELATERD1元件、1个ACGTATERD1和3个ABRERATCAL元件。Nakashima等报道，拟南芥脱水诱导基因RD29B和RD29A启动子中ABA响应元件ABREs与亮氨酸拉链类(bZIP)转录因子AREBs结合，激活靶基因在特定环境条件下表达[32]。因此，BpbHLH112启动子中的ABREs元件对该启动子在ABA处理下的活性升高可能是一种正调控作用，但是BpbHLH112基因是通过依赖或不依赖ABA信号途径对高盐和干旱胁迫产生应答反应尚需进一步的研究。

钙离子(Ca2+)作为第二信使参与各种细胞内以及细胞间信号转导，以钙离子及其靶蛋白钙调素为核心的钙信使系统在植物应对逆境胁迫的信号转导过程中起着中心作用[33～34]。Yang报道，6个拟南芥信号应答基因AtSR1-6能够被多种环境胁迫如高温、高盐、UV、损伤以及多种信号分子如茉莉酸甲脂、H2O2和SA处理诱导表达，AtSR1-6基因编码钙调素结合蛋白，它们与CGCGBOX基序结合促进抗逆基因的激活与表达[35]。在BpbHLH112启动子区域存在有4个CGCG box元件，对其可能结合的钙调素结合蛋白的鉴定及其功能可以进一步深入研究。此外，BpbHLH112启动子还包含有3个TAAAG元件，该种元件参与了马铃薯保卫细胞中K+渗入通道基因KST1的表达[36]，因此，对BpbHLH112启动子TAAAG元件功能的进一步研究可能了解TAAAG元件结合的调控因子以及控制保护细胞特异性基因表达的机制。

本研究初步分析了BpbHLH112基因及其启动子响应高盐、干旱和外源ABA胁迫下的表达模式，发现了一些与非生物胁迫以及逆境信号传导相关的元件，为后续研究该基因启动子转录应答反应机制提供了理论基础，后续研究可构建启动子5′缺失突变体和主要调节区域定点突变，从而找到核心启动子区域和功能作用元件，进一步应用于林木遗传育种改良研究。