“凤丹”牡丹花丝愈伤组织诱导及分化研究

杜一鸣 钟 原 尚宏芹 成仿云*

(1.北京林业大学林木分子设计育种高精尖创新中心，牡丹国际研究院，国家花卉工程技术中心，园林学院，北京 100083；2.菏泽学院农业与生物工程学院，菏泽 274015)

牡丹是我国传统名花，集观赏、药用、油用、文化载体等重要价值于一体，是一类极具综合开发潜力的物种。近年来研究表明，牡丹种子产量高、且富含食用油中缺少的不饱和脂肪酸尤其是α-亚麻酸，因此牡丹作为一种优良的木本油料资源受到市场的广泛关注[1～2]。然而，传统繁殖方法如嫁接、分株等严重制约了其繁殖效率和育种进程，如何建立一种高效稳定的体外再生体系是牡丹育种和产业发展亟待解决的问题。

组织培养是离体快繁和利用基因工程进行遗传改良的重要基础之一。在牡丹中，组织培养一直受到广泛关注，以往的研究主要涉及微繁殖[3～4]、胚培养[5]、体胚直接发生[6]及愈伤组织诱导与分化[7～8]等方面，但由于存在玻璃化、生根困难、增殖率低、褐化等许多问题，目前尚未建立起可应用于实际生产和遗传转化的再生体系。愈伤组织再生体系是最常用的遗传转化受体系统之一[9]，牡丹愈伤组织虽然可使用多种外植体如子叶[10]、叶柄[7]、叶片、茎段、花瓣、花药等[8]诱导获得，但愈伤组织的分化十分困难，仅有少量不定芽或球形胚分化，因此，如何诱导胚性愈伤组织并促进其分化是牡丹组织培养技术研究的关键。

本研究中，我们尝试开发一种新的外植体。利用花丝为外植体进行体外再生在许多植物中获得了成功，如葡萄[11]、费约果[12]、黄花七叶树[13]等，而牡丹花丝在愈伤组织诱导中几乎没有应用。前期预实验表明，相较于其他外植体，花丝对愈伤组织诱导反应良好，且对发育时期要求不那么严格，在花丝着色变红之前的各时期均有很高的愈伤组织诱导率；花丝取材数量多，操作方便，是一类良好的外植体来源。因此，本文采用“凤丹”幼嫩花丝作为外植体，探究了发育时期、基本培养基和植物生长调节剂(plant growth regulators,PGRs)对花丝愈伤组织诱导、增殖及分化的影响，并进行了愈伤组织的组织学分析，以期为牡丹体外再生体系的建立提供基础和参考。

1 材料和方法

1.1 外植体制备

试验所用的“凤丹”牡丹均来自北京延庆国色牡丹园，于2019年3月30日至4月20日，每隔5 d采一次“凤丹”花蕾，共采样5次，各时期花蕾直径分别为13.65 mm±0.14 mm、16.17 mm±0.30 mm、18.62 mm±0.23 mm、22.07 mm±0.57 mm、25.22 mm±0.13 mm(见图1A)。将整个花蕾置于塑料瓶中，洗涤精浸泡5 min，流水冲洗10 min，转至超净工作台上，75%乙醇消毒1 min，3%次氯酸钠消毒2次，每次5 min，无菌水冲洗3～5遍，然后置于无菌滤纸上，用镊子和手术刀剥出花丝，切成3～5 mm，做为外植体，接种至愈伤组织诱导培养基上，每皿20～25个(见图1B)，每个花蕾处理6皿。

图1 不同发育时期的“凤丹”花蕾及花丝启动培养 A.不同发育时期的“凤丹”花蕾(除去花被)，从左至右分别为1～5时期；B.花丝启动培养Fig.1 Flower bud at different developmental stages of P.ostii ‘Feng Dan’ and initiation culture of the filaments A.Flower bud at different developmental stages of P.ostii ‘Feng Dan’(the perianth were removed),1-5 periods from left to right,respectively; B. Initiation culture of the filaments

1.2 培养基和培养条件

将1～5发育时期的花丝分别接种至MS培养基，添加1.0 mg·L-12,4-二氯苯氧乙酸(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid，2,4-D)、1.0 mg·L-1萘乙酸(1-Naphthaleneacetic acid，NAA)、0.5 mg·L-16-苄氨基腺嘌呤(6-Benzyladenine，BA)、水解酪蛋白(Casein hydrolysate，CH)500 mg·L-1、蔗糖30 g·L-1、琼脂6.5 g·L-1，探究发育时期对花丝愈伤组织诱导的影响。根据试验结果，选取直径为13～19 mm，半透明或白色的花丝为外植体，进行以下试验。

愈伤组织诱导采用L9(34)正交设计，包括培养基(MS、SH、DKW)、2,4-D(0、1.0、2.0 mg·L-1)、NAA(0、1.0、2.0 mg·L-1)、BA(0.1、0.2、0.5 mg·L-1)，共9个处理，均添加CH 500 mg·L-1、蔗糖30 g·L-1、琼脂6.5 g·L-1。

愈伤组织增殖采用SH培养基，添加2,4-D(0.1～1.0 mg·L-1)、NAA(0.1～1.0 mg·L-1)、BA(0.05～0.25 mg·L-1)，以及CH 500 mg·L-1、蔗糖30 g·L-1、维生素C 20 mg·L-1、AgNO35 mg·L-1、琼脂6.5 g·L-1。

愈伤组织分化采用MS培养基，添加不同浓度的毒莠啶(Picloram，PIC)、NAA、BA、噻苯隆(Thidiazuron，TDZ)、氯吡苯脲(N-(2-chloro-4-pyridyl)-N-phenylurea，CPPU)，以及CH 500 mg·L-1、蔗糖80 g·L-1、琼脂8.0 g·L-1。

所有培养基pH调至5.8，120℃下灭菌20 min。愈伤组织诱导和增殖在黑暗条件下，分化培养在16 h·d-1光照条件下，光照强度为50 μmol·m-2·s-1，光源为LED(70%红光+30%蓝光)。培养温度均为23℃，继代周期为20 d。

1.3 组织切片制作

对不同处理的愈伤组织进行石蜡切片制作及显微观察，具体步骤为FAA固定→乙醇梯度脱水→二甲苯透明→浸蜡→包埋→切片→粘片→染色→封片，切片厚度为8 μm，染色采用苏木精—伊红及番红复染，切片机型号为LEICA RM2245，显微镜型号为LEICA ICC50 HD。

1.4 数据统计分析

诱导培养60 d后统计愈伤诱导率和诱导量，增殖培养两代后统计增殖系数，分化培养90 d统计分化率。数据分析采用SPSS17.0进行方差分析和邓肯多重检验。

2 结果与分析

2.1 发育时期对“凤丹”花丝愈伤组织诱导率的影响

将不同发育时期的花丝接种至培养基中，观察愈伤组织诱导情况。1～3时期为雄蕊发育早期，此时花药呈淡黄色，花丝呈半透明或白色，这3个时期的花丝均获得了较高的愈伤组织诱导率，最高为第3时期，为87.50%±4.17%，3个时期的诱导率无显著差异。第4和第5时期的花丝逐渐变红老化，伴随着花丝愈伤组织诱导率显著下降(见表1)，表明1～3时期较幼嫩的花丝更适宜愈伤组织的诱导。

表1 发育时期对“凤丹”花丝愈伤组织诱导率的影响

Table 1 The effect of filament developmental stage on callus induction rate ofPaeoniaostii‘Feng Dan’

花丝发育时期Filamentdevelopmentalstage12345诱导率Inductionrate(%)80.00±0.00a80.00±2.00a87.50±4.17a29.27±11.38b18.87±7.63b

注：表中小写字母表示在0.05水平上差异显著，下同。

Note:different letters show significant differences at 0.05 level,the same as below.

2.2 基本培养基和PGRs对“凤丹”花丝愈伤组织诱导的影响

将花丝接种至诱导培养基约15 d，从花丝两端切口处开始形成愈伤组织，然后逐渐包围外植体。除1号处理的外植体褐死外，其余各处理均得到了较高的愈伤组织诱导率。不同处理间愈伤组织诱导率和诱导量差异显著，其中7号处理愈伤组织诱导率和诱导量均为最高，诱导率可达99.12%±2.15%，诱导量为5.68 g±1.42 g(表2)。方差分析表明，基本培养基、2,4-D、NAA及BA对“凤丹”花丝愈伤组织诱导率和诱导量均有显著影响。对于诱导率来说，各因素的主效应为BA>基本培养基>2，4-D>NAA，各因素的最佳水平分别为2,4-D 2 mg·L-1、NAA 2 mg·L-1、0.2 mg·L-1BA及SH培养基，但由于各因素的K2和K3之间没有显著差异，在诱导过程中可选择较低浓度的PGRs，即1 mg·L-12,4-D、1 mg·L-1NAA及0.2 mg·L-1BA；而对于诱导量来说，各因素的主效应为基本培养基>BA>NAA>2，4-D，各因素的最佳水平分别为2,4-D 2 mg·L-1、NAA 2 mg·L-1、0.5 mg·L-1BA及SH培养基，由于2,4-D和BA的K2和K3之间没有显著差异，在实验中可选用较低的浓度，即1 mg·L-12,4-D和0.2 mg·L-1BA。综合考虑诱导率和诱导量，“凤丹”花丝愈伤组织诱导最适培养基为SH培养基、1 mg·L-12,4-D、2 mg·L-1NAA及0.2 mg·L-1BA(表3～4)。

表2 基本培养基和PGRs对“凤丹”花丝愈伤组织诱导的影响

表3 “凤丹”花丝愈伤组织诱导率和诱导量的方差分析

表4 “凤丹”花丝愈伤组织诱导率和诱导量的多重比较和极差

2.3 “凤丹”花丝愈伤组织形态组织学观察

“凤丹”花丝愈伤组织按照形态和解剖结构可分为三类：Ⅰ类愈伤组织外观金黄色或亮黄色，质地较松软，水分含量较高(见图2:A～B)；Ⅱ类愈伤组织生长量大，黄白色或黄色，质地较硬，表面较光滑或呈颗粒状，部分表面有细碎白色愈伤(见图2:C～E)；Ⅲ类愈伤组织生长量小，黄褐色或褐色，培养过程中逐渐褐化，较致密，表面呈细小颗粒状(见图2:F～H)。组织学研究表明Ⅰ类愈伤组织主要由胚性细胞组成，表现为细胞核大，细胞质浓，核质比高，呈现显著的分生细胞特征(见图3:D,G)；Ⅱ类愈伤组织由胚性细胞和非胚性细胞组成，整个外植体靠近表皮的部位，分布大量的胚性细胞，并形成许多小的突起。在这类愈伤组织内部，存在许多非胚性细胞，此外还有大量的维管组织分化，呈团状或片状，有的维管组织周围有薄壁细胞包围，形成分生结节(见图3:E,H)。Ⅲ类愈伤组织结构介于Ⅰ类和Ⅱ类之间，在愈伤组织表层和内部均存在大量胚性细胞，愈伤组织表面有许多胚性细胞形成的突起，同时，愈伤组织内部存在大量维管组织及分生结节的分化(见图3:F,I)。

本研究发现愈伤组织形态结构的差异主要与基本培养基种类相关，Ⅰ类愈伤组织主要是在MS培养基上产生，Ⅱ类愈伤组织是在SH培养基上产生，而Ⅲ类愈伤组织是在DKW培养基上产生，表明相对于PGRs来说，基本培养基的组分对愈伤组织类型具有更为显著的影响。

2.4 “凤丹”花丝愈伤组织的增殖

PGRs浓度和配比对“凤丹”花丝愈伤组织增殖率具有显著影响，在添加0.5 mg·L-12,4-D、0.5 mg·L-1NAA及0.25 mg·L-1BA的SH培养基上，愈伤组织增殖系数最高，为3.81±0.97，在不添加任何PGRs的培养基上，增殖系数最低，为1.84±0.75。愈伤组织诱导培养基对愈伤组织增殖也有显著影响，除1号培养基未产生愈伤组织，3、4及8号培养基愈伤组织在继代过程中逐渐褐死外，其余各处理的愈伤组织用来进行增殖试验，其中5号培养基上产生的愈伤组织具有最高的增殖率，为3.86±0.58，表明其具有最高的分裂活性(见表5)。

表5 PGRs和启动培养基对“凤丹”花丝愈伤组织增殖的影响

图2 不同诱导培养基上的“凤丹”花丝愈伤组织 A～B. MS培养基上的Ⅰ类愈伤组织，分别来自5号(A)和9号(B)处理；C～E. SH培养基上的Ⅱ类愈伤组织，分别来自2号(C)、6号(D)和7号(E)处理；F～H. DKW培养基上的Ⅲ类愈伤组织，分别来自3号(F)、4号(G)和8号(H)处理Fig.2 Calluses from filaments of P.ostii ‘Feng Dan’ on different induction medium A-B. Type Ⅰ callus on MS medium from No.5(A) and No.9(B) treatment,respectively; C-E. Type Ⅱ callus on SH medium from No.2(C),No.6(D) and No.7(B) treatment,respectively; F-H. Type Ⅲ callus on DKW medium from No.3(F),No.4(G) and No.8(H) treatment,respectively

图3 “凤丹”花丝愈伤组织的组织学观察 A,D,G.Ⅰ类愈伤组织(A.金黄色、质地松软的胚性愈伤组织；D.胚性愈伤组织主要由胚性细胞组成；G.核大质浓的胚性细胞)；B,E,H.Ⅱ类愈伤组织(B.黄白色、质地坚硬的愈伤组织；E,H.愈伤组织表层分布胚性细胞，形成许多小突起(红色箭头)，内部有大量维管组织分化(黑色箭头))；C,F,I.Ⅲ类愈伤组织(C.黄褐色或褐色、质地较硬的愈伤组织;F,I.愈伤组织表面有许多胚性细胞形成的突起(红色箭头)，内部同时存在胚性细胞和非胚性细胞，以及大量维管组织分化(黑色箭头))Fig.3 Histological observation of calluses from filaments of P.ostii ‘Feng Dan’ A,D,G. Type Ⅰ callus(A. Golden yellow,loose embryogenic callus; D. Embryogenic callus is composed of embryogenic cells; G. embryogenic cells present evident nucleus and dense protoplasm); B,E,H. Type Ⅱ callus(B. Yellow-white and compact callus; E,H. The embryogenic cells were distributed on the surface of callus and formed several small protuberances(red arrows) ,while plenty of vascular tissues were formed inside the callus(black arrow)); C,F,I. Type Ⅲ callus(C. Yellowish brown or brown,compact callus; F,I. Several protuberances were formed on the surface of the callus,which were composed of embryogenic cells,both embryogenic and non-embryogenic cells existed inside the callus,as well as a large amount of vascular tissues(black arrow))

图4 “凤丹”花丝愈伤组织分化 A.Ⅰ类愈伤组织上体胚分化；B. Ⅱ类愈伤组织表面形成绿色或红色突起；C. Ⅱ类愈伤组织上不定芽分化Fig.4 Differentiation of callus from filaments of P.ostii ‘Feng Dan’ A. Somatic embryogenesis from type Ⅰ callus; B. A large number of green or red protuberances formed from type Ⅱ callus; C. Shoots organogenesis from type Ⅱ callus

2.5 “凤丹”花丝愈伤组织的分化

将“凤丹”花丝愈伤组织转至分化培养基上，得到了少量的分化。其中，金黄色、松软的Ⅰ类胚性愈伤组织，在转入含有0.5 mg·L-1PIC、0.5 mg·L-1BA及80 g·L-1蔗糖的MS培养基2个月后，观察到了鱼雷期体胚的分化，分化率为3%(见表6)。体胚着生于愈伤组织表面，外观黄色，具有完整的茎端与根端，根部与愈伤组织存在少量连结，易与愈伤组织分离(见图4A)。此外，试验还观察到了少量不定芽的分化，在含有0.25 mg·L-1NAA、0.5 mg·L-1BA及80 g·L-1蔗糖的MS培养基上，黄白色、质地坚硬的Ⅱ类愈伤组织逐渐变成致密的结节状，表面呈绿色或呈红色(见图4B)，2个月后得到了5%的不定芽分化率(见表6)，不定芽呈绿色，与体胚具有明显的形态结构差异，缺少根端，基部与愈伤组织紧密连结(见图4C)。

表6 “凤丹”花丝愈伤组织分化情况

3 讨论

外植体种类和发育时期是影响植物愈伤组织诱导的重要因素，通常较幼嫩的外植体更适宜进行愈伤组织的诱导和再生[14]。牡丹愈伤组织可由多种外植体产生，紫斑牡丹叶柄愈伤组织诱导率可达100%，进一步诱导得到了分生结节[7]；“凤丹”叶片、茎段、花药、花瓣愈伤诱导率为50.8%～98.9%，不定芽分化率为22.22%～34.81%[8]；“凤丹”子叶愈伤组织诱导率可达91.26%[10]，但均未有明显的体胚分化。幼嫩花丝可作为体外再生的外植体，在葡萄等植物中获得了愈伤组织及体胚的分化，但在牡丹上很少应用[15]。本研究表明“凤丹”幼嫩花丝适于进行愈伤组织诱导，诱导率高达99.12%，组织学分析及体胚和不定芽的分化证实了胚性愈伤组织的存在，并首次观察到了间接发生的鱼雷期体胚，表明“凤丹”花丝是一种良好的有再生潜力的外植体来源。

培养基组分对植物细胞生长具有重要的影响，不同的植物种类及外植体对培养基的反应具有显著差异，根据不同的培养目的，选择最合适的基本培养基是植物体外再生的必要条件。如针叶树常用的培养基有LV、mLV及DCR等[16～17]；木本植物常用的WPM和DKW等[18～19]。本研究中，基本培养基组分对“凤丹”花丝愈伤的诱导率、诱导量及愈伤组织形态结构均具有显著的影响。SH培养基上获得了最高的愈伤组织诱导率和诱导量，但仅在MS培养基上得到了金黄色、质地松软的胚性愈伤组织，而SH和DKW培养基上的愈伤组织质地较硬，内部存在大量维管组织分化。在后续继代分化过程中，这3种愈伤组织的表现也存在明显的差异，表明基本培养基对植物细胞生长和分化具有重要影响。类似的结果已有大量报道，在紫斑牡丹愈伤组织及分生结节的诱导过程中，SH和1/2MS培养基上的愈伤率要显著高于WPM培养基，SH培养基上的褐化率则显著低于另外两种[7]；在“凤丹”子叶愈伤组织诱导及分化过程中，MS和1/2MS明显优于WPM、White培养基，仅在MS和1/2MS上观察到了不定芽的分化[20]。

激素是影响植物细胞生长发育的关键因素。在植物愈伤组织诱导及分化过程中，生长素和细胞分裂素是最常用的激素，其种类、浓度及配比决定了细胞发育的方向[9]。本研究中，单独使用BA，无法诱导花丝愈伤的产生，而在含有2,4-D、NAA的所有培养基上，都得到了较高的愈伤组织诱导率，因此，生长素对于“凤丹”花丝愈伤的诱导是必需的。2,4-D、NAA、BA浓度对“凤丹”花丝诱导率和诱导量均有显著的影响，当2,4-D 1 mg·L-1、NAA 2 mg·L-1、BA 0.2 mg·L-1时，最适于“凤丹”花丝愈伤组织的诱导；当2,4-D 0.5 mg·L-1、NAA 0.5 mg·L-1、BA 0.25 mg·L-1时，最适于“凤丹”花丝愈伤组织的增殖。

细胞的内部生理状态和外部培养条件决定了其发育方向，只有具有全能性或多能性的细胞才能进行形态发生。细胞全能性是指细胞在适当条件下能够模拟合子胚发育成一个完整的有机体，如体胚的发生；多能性是指细胞具有定向发育成某种器官的能力，如不定芽或不定根形成[9]。本研究观察到了3种不同形态结构的愈伤组织，其中都存在胚性细胞区域，表明它们都具有一定的分化潜力。Ⅰ类愈伤组织具有典型的胚性愈伤组织特征，包括细胞核大质浓、核质比高、质地松软等，在许多植物中有过类似报道，这类愈伤组织具有分化体胚的潜力[21～22]。本研究也观察到了鱼类形时期的体胚，证实此类愈伤确实具有体胚分化的潜力。Ⅱ类愈伤组织和Ⅲ类愈伤组织结构致密，内部呈现大量的维管组织分化，大多数器官分化的愈伤组织具备此类结构特征[23～24]。在Ⅱ类愈伤组织上，本研究也观察到了部分不定芽的分化，证实了此类愈伤组织具有器官分化的潜力。Ⅲ类愈伤组织在培养过程中呈褐色，尚未观察到明显分化，可能是分化条件不适宜。在未来的研究中，通过改良培养基组分，提高胚性愈伤组织分化率、促进体胚及器官再生是关键。