外周血清5-羟色胺与血小板水平对肝细胞癌患者预后的影响

王志鑫，李 姚，周留馨，任 利，曲 凯，苗 润，侯立朝，王海久，刘 昌，樊海宁

1 青海大学附属医院 肝胆胰外科，西宁 810000；2 青海省包虫病重点实验室，西宁 810000；3 西安交通大学第一附属医院 肝胆外科，西安 710006

肝癌是全球性高发病率、病死率的恶性肿瘤之一，尽管部分患者可以通过手术治疗达到根治，然而术后超过70%的肝癌患者可以发生肿瘤复发或远处转移，高达90%以上的死亡与肿瘤转移/复发有关[1]。研究[2]证明肝癌主要通过血行转移，血小板可能在其转移过程中发挥重要作用，然而机制尚未明晰。本研究拟回顾性分析肝细胞癌患者外周血小板计数与临床病理特征的关系，了解影响肝癌患者预后(整体、无复发生存期)的独立危险因素，并进一步分析血小板计数与患者生存期的相关性。此外，通过对比肝癌转移组与非转移组患者外周血小板计数、聚集功能及血清游离5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)间的差异，进一步了解血小板与肝细胞癌复发/转移的关系，同时明确外周血游离5-HT与肝癌复发/转移的相关性。

1 资料与方法

1.1 研究对象 回顾性分析2004年1月-2012年12月于西安交通大学第一附属医院肝胆外科、消化内科、周围血管科治疗的210例肝细胞癌患者临床资料。纳入及排除标准如下：(1)≥18周岁；(2)符合NCCN指南肝癌诊断标准；(3)初治病例，无既往肿瘤相关病史及治疗经过；(4)无其他影响血小板数量和功能的疾病：如原发性血小板增多症；骨髓增生性疾病(例如慢性粒细胞白血病、真性红细胞增多症、骨髓纤维化等)；血小板反应性增多(如急性出血、缺铁、急慢性感染及溶血等)；(5)无近/长期可影响血小板功能/数量的药物或其他治疗。在收集的210例患者中选取52例肝细胞癌患者(包括20例肝癌复发/转移者及32例非复发/转移患者)行外周血血小板聚集功能、游离5-HT检测，病例需符合以下条件：(1)≥18周岁；(2)符合NCCN指南肝癌诊断标准，且此次入院明确诊断为肝癌复发/转移；(3)无其他影响血小板数量/功能的疾病：如原发性血小板增多症；骨髓增生性疾病(如慢性粒细胞白血病、真性红细胞增多症、骨髓纤维化等)；血小板反应性增多(如急性出血、缺铁、急慢性感染及溶血等)；(4)无近/长期可影响血小板功能/数量的药物或其他治疗。

1.2 资料获取及样本检测 利用医院病案室病历缩微系统，对病历进行筛选复合，将原始病历资料建立原始数据库，采集项目包含患者一般信息、入院时常规及肿瘤相关检验、检查数据。自收集患者病历起，每3个月电话随访以及信访，如果出现2年或者以上无法联系者，则视为失访。所有回顾分析的病例随访截止时间为2014年12月31日，研究起始时间为接受主要的治疗(手术/TACE/射频消融/化疗)，结束时间为患者死亡、最后1次随访时间或者失访。随访内容包括术后生活情况、复发时间、是否死亡、死亡时间及死亡原因。如果在随访期间患者死于原癌及相关疾病则患者资料为完全数据，如果至随访截止日期患者生存则按照截尾数据处理。

采集空腹外周静脉血标本5 ml 2管(采集前7～10 d患者未服用阿司匹林或含有阿司匹林的药物)，采用SE 2100型全自动血液细胞分析仪测定血小板计数、使用血小板聚集仪检测外周血小板聚集率。然后将试剂及血浆样品置于室温下(20 ℃～25 ℃)进行温度平衡，计算试剂用量，样本与标准品进行双份实验，完成5-HT ELISA检测。

1.3 伦理学审查 本研究方案经由青海大学附属医院伦理委员会审批(批号：P-SL-2019072)，患者均签署知情同意书。

2 结果

2.1 一般资料 按照纳入排除标准最终纳入肝癌病例1102例，经过筛选和随访，最终得到有效病例210例，一般资料见表1。

表1 肝癌患者基线资料

将210例患者分为低血小板组(≤150×109/L)129例(61.4%)与高血小板组(>150×109/L)81例(38.6%)，分析血小板计数与肝癌患者临床病理特征间的相关性。结果发现，不同血小板水平患者的年龄(χ2=32.304，P=0.044)、肿瘤大小(χ2=35.201，P=0.001)、肿瘤数目(χ2=31.304，P=0.032)、Child分级(χ2=31.250，P=0.036)及TNM分期(χ2=35.201，P=0.001)等指标差异均有统计学意义，提示血小板与肝癌进程关系密切。

2.2 肝癌患者预后影响因素分析 单因素分析发现，年龄、入院AFP水平、肿瘤大小、静脉侵袭、入院血小板计数、TNM分期及治疗方式为患者整体生存及无复发生存的危险因素(P值均<0.05)。多因素Cox分析发现，与患者生存相关的独立危险因素有年龄、入院AFP水平、入院血小板计数、治疗方式(P值均<0.05)，而与无复发生相关的危险因素包括年龄、入院AFP水平、肿瘤大小、入院血小板计数、治疗方式(P值均<0.05)(表2，3)。

2.4 外周血小板、血5-HT与肝癌患者复发/转移的关系 对比分析20例住院的肝癌复发/转移患者及32例非复发/转移患者外周血小板计数、聚集功能的差异，结果发现2组血小板计数、血小板聚集率、血清游离5-HT水平差异均有统计学意义(P值均<0.05)(表4)。进一步相关性分析发现，血清5-HT水平与外周血小板计数及最大聚集率均呈正相关(P值均<0.05)(图2)。

3 讨论

尽管目前针对肝癌已有多种治疗措施，但包括移植在内的手术治疗、放疗和化疗[3]，均存在着应用的局限性，较高的复发率以及治疗的不彻底性，因此现有的治疗方法都不能从根本上解决这一难题。近年来，越来越多的研究者从肿瘤微环境入手开展了大量的研究工作，期待从新的角度揭示肝癌的起因及进展机制，以期从中发现新的、更好的肿瘤治疗靶点。

血小板广泛存在于机体内，由巨核细胞生成，是血液循环中最小的血细胞。血小板早先是作为血液系统生理变化的主要参与者之一被认知，其主要功能是阻止组织损伤及血管损伤后出血。近年来越来越多的研究将关注点放在血小板与肿瘤的关系方面。目前学界也有观点认为，血小板对肿瘤患者预后具有积极意义。例如，有学者[4]对216例结肠癌肝转移或者肝切除术后患者的预后进行观察发现，血小板数低于100×109/L的患者术后肝功能恢复时间延长，且病死率更高，也有许多研究[5-8]支持血小板减少症及低血小板水平对接受肝切除的肝癌患者预后具有不利影响的观点。另外，研究发现在肝移植术后血小板输注可以促进肝再生[9]，而利用血小板特异性抗体减少血小板含量或用血小板活性抑制剂抑制血小板功能，均使小鼠部分肝切除后肝再生明显降低[10]。提示血小板可能通过促进肝再生对肝癌患者术后生存产生积极影响。

表2 影响肝癌患者生存的危险因素分析

表3 肝癌患者无瘤生存危险因素分析

表4 2组患者外周血5-HT及血小板相关指标比较

目前几个基于血小板的预测指数已经被确定为肝癌的预测指标，如Tamaki等[11]报道FIB-4>3.25可以增加约1.7倍的肝癌发病风险。Sitia等[12]动物实验发现，在对免疫介导的慢性HBV的小鼠应用抗血小板药物，如阿司匹林和氯吡格雷后，可以明显抑制动物模型肝癌的发生率。然而，还有相当数量的临床研究结果提示血小板对于肝癌患者预后有消极的影响，例如Nouso等[13]将血小板>80×109/L视为肝功能Child C级的肝硬化肝癌患者整体不佳的独立预测因素，而临床观察发现，高血小板水平在包括肝癌在内的部分肿瘤(例如：子宫内膜癌[14]、宫颈癌[14]、卵巢癌[15-16]乳腺癌[17]大肠癌[18]及胃癌[19]等实体肿瘤)中是预后不良因素，诊断时的血小板增多会导致许多类型的肿瘤长期存活率下降[20-22]。甚至还有基础研究证实了血小板可以促进肝癌等多种肿瘤细胞的增殖、侵袭、血管生成和转移。

由于血小板与肝癌患者预后关系的结论不一，本研究收集肝癌患者资料，进行了相关性及预后分析，结果发现，血小板计数与肝癌患者整体预后及复发/转移密切相关，且血小板计数越高，其生存期越短、复发率越高，这与既往部分肝癌相关研究结果一致。

尽管既往研究报道血小板可以通过多种途径影响肿瘤细胞，然而目前为止具体机制仍未完全明晰。通常认为血小板通过活化形式发挥作用，其主要变化是血小板独立分泌活性因子。其内的大量α颗粒、致密颗粒等在活化状态下向外释放糖蛋白、凝血因子和许多促血管生成因子与抗血管生成因子等，进而发挥其生物学作用。5-HT是体内重要的内源性活性物质，90%以上储存在外周循环的血小板中，血小板是储存和运输5-HT的重要物质[23]。研究发现，血小板源性的5-HT通过与其受体5-HT2A和5-HT2B结合，在大鼠肝脏的再生过程中起着关键性作用。此外，还发现5-HT与肝纤维化[24]、非酒精性肝炎及病毒性肝炎的发病机理相关，甚至在肿瘤相关研究中发现血小板源性的5-HT能够促进包括胆管癌[25]和肝细胞癌[26]在内的多种肿瘤生长，且胆管癌患者血浆中高5-HT水平也提示预后较差[27]。与此同时，也有学者[28]认为5-HT的表达水平与胃癌的分化程度密切相关。

基于上述原因，本研究推测血小板对肝癌进程的影响可能与其内所含的大量内源性5-HT密切相关，因此通过检测对比不同组肝癌患者外周血小板计数、功能及5-HT水平及相关性对本研究的推测进行初步验证。结果发现，血小板计数、活化程度及5-HT水平在肝癌转移组均较非转移组偏高，还发现血清5-HT水平与外周血小板计数及聚集率均呈正相关。这提示血小板及5-HT与肝癌患者预后均存在密切关联，提示血小板源性的5-HT可能在肝癌复发、转移中发挥重要作用，为进一步研究提供了一定的基础和依据。