生物合成槲皮素糖苷类衍生物的研究进展

封悦洋，王颖，姚明东，肖文海，丁明珠

（1 天津大学前沿技术研究院，天津301700； 2 天津大学合成生物学前沿科学中心，天津300072；3天津大学系统生物工程教育部重点实验室，天津300072）

引 言

糖苷是自然界中最普遍和最重要的物质之一，它在细胞通讯和生命协调中起到核心作用。糖苷类衍生物是在糖基转移酶的作用下将糖基连接到苷元上而形成的一类产物。在植物中，糖苷分布广泛，种类繁多。这些糖苷类衍生物往往表现出良好的溶解、生物活性或稳定性[1]。例如红霉素[2]的糖基化可以提高水溶性，盏灯花素[3]和熊果苷[4]具有抗癌、抗氧化作用，而槲皮素[5]的糖基化可以通过保护其敏感化学基团和不稳定结构来提高其稳定性，并对α-葡萄糖苷酶或P450 酶表现出活性抑制作用[6-7]。

植物提取是获得糖苷最普遍的方法，而有些植物生长周期长[8]，且产量严重依赖于地理位置、季节环境等多种因素。天然糖苷的有机合成仍然存在挑战，特定糖苷键的立体选择性形成常常受到许多反应基团的影响[9]，这需要各种保护和去保护步骤，由此产生的有毒废物使其无法进行大规模生产。因此，在高市场需求和可持续性的推动下，生物发酵成为有发展潜力的解决方案。随着微生物细胞工厂的广泛应用，目前已经在大肠杆菌和酿酒酵母等模式生物中合成多种植物糖苷，如红景天苷[10]、东莨菪素[11]、人参皂苷[12]、香兰素-4-O-葡糖苷[13]、天竺葵-3-O-葡萄糖苷[14]等。但糖苷在微生物中的产量并不高。主要问题在于糖基转移酶与底物的适配性、前体UDP-糖供给不足或者宿主合成的植物苷元含量低不足以进行糖基化反应、有些植物苷元对微生物宿主产生毒性等，这些问题阻碍了生物合成糖苷产量的提升[15-17]。

槲皮素是自然界中最广泛的一种黄酮类化合物，有100多种植物含有槲皮素，目前已经在植物中鉴定出300 多种不同的槲皮素糖苷类衍生物[15]。早在2004 年就已经实现槲皮素-3-单葡萄糖苷、槲皮素-3,7-双葡萄糖苷的生物合成[18-19]。由于槲皮素糖苷衍生物具有抗癌、抗氧化等多种生物学效应[20]，成为国内外诸多领域的研究热点。近些年来随着合成生物学和代谢工程的快速发展，利用工程菌株生物合成槲皮素糖苷取得了巨大的进展。本文将以槲皮素糖苷的生物合成为例，对槲皮素糖苷类衍生物的前体槲皮素和糖基单元以及糖基转移酶的催化反应过程进行系统的阐述，对提高工程菌株生物合成糖苷类化合物进行综述和展望，为以后的深入研究和工业化生产提供参考。

1 槲皮素糖苷类衍生物

槲皮素分子含有5 个羟基，又称为3,5,7,3',4'-五羟基黄酮。槲皮素中的C-3、C-7 和C-4'位羟基易于发生糖基化反应。研究表明，二磷酸尿苷糖（UDP-sugars）是植物糖苷的糖基提供者，槲皮素和二磷酸尿苷糖在糖基转移酶（UGT）的催化作用下可形成糖苷，如槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-7-O-葡萄糖苷、槲皮素-4'-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-半乳糖苷。此外，槲皮素分子上可以连接多个糖基单元，从而形成槲皮素二糖或多糖（图1），如槲皮素-3-O-葡萄糖-7-O-鼠李糖苷、槲皮素-3,7-O-双葡萄糖苷[21]。

1.1 槲皮素的生物合成

槲皮素是一种生物活性黄酮醇，主要存在于洋葱、苹果、浆果和西兰花等经常食用的植物性食物中。它具有抗氧化、抗癌、抗炎、抗病毒、免疫调节等作用，且对人体无毒[20]。槲皮素的生物合成，依赖于内质网膜和质膜上多种酶的协同作用[22]。其中，第一步是苯丙烷合成途径，该途径通过三个酶将苯丙氨酸（Phe）转化为4-香豆酰辅酶A。随后，通过苯丙氨酸氨裂合酶（PAL）、肉桂酸4-羟化酶（C4H）和4-香豆酰辅酶A 连接酶（4CL）的依次催化作用[23]，形成4-香豆酰基辅酶A分子。然后，在查尔酮合酶（CHS）作用下将一分子4-香豆酰基辅酶A与三分子丙二酰基-CoA 缩合，生成柚皮素查尔酮，这是9000 多种黄酮类衍生物的基本骨架[24]。接着，查耳酮异构酶（CHI）催化杂环C 的闭合，生成柚皮素，柚皮素是所有黄酮醇的通用前体。柚皮素借助黄酮3-羟化酶（F3H）合成二氢山柰酚，二氢山柰酚作为黄酮3'-羟化酶(F3'H)的底物生成二氢槲皮素，最后通过黄酮醇合成酶1（FLS1）的作用合成槲皮素[25]（图2）。

图1 槲皮素及其糖苷衍生物Fig.1 Quercetin and its glycoside derivatives

图2 植物中槲皮素生物合成路径Fig.2 Biosynthetic pathway for quercetin biosynthesis in plant

目前在多种微生物中实现了槲皮素的生物合成。利用工程酵母体外添加苯丙氨酸作为初始前体，在酵母中添加植物外源基因，即来自杨树（Poplar）的PAL，来 自 大 豆(Glycine max)的C4H、4CL、CHS、CHI、F3H、F3'H 和来自马铃薯(Solanum tuberosum)的FLS，实现槲皮素的生物合成，产量为0.38 mg/L[26]。在生产对香豆酸的大肠杆菌中添加6种植物来源的生物合成酶（即F3'5'H-CPR，4CL,CHS, CHI, FHT, FLS）实现了槲皮素的生物合成[27]。在链霉菌中，使用来自荚膜红细菌（Rhodobacter capsulatus）的酪氨酸氨裂合酶（TAL）进行异源生物合成，将L-Tyr直接转化为对香豆酸，同时引入荷兰芹（Petroselinum crispum）来源的柚皮素3-双加氧酶（N3DOX）合成二氢山柰酚，最后通过来自拟南芥（Arabidopsis thaliana）的F3'H 和FLS1 首次在链霉菌中实现了槲皮素的全合成，产量为0.599 mg/L[28]。在谷氨酸棒状杆菌中，以咖啡酸作为前体，分别表达来自荷兰芹（Petroselinum crispum）的4CL，矮牵牛（Petunia x hybrida）的CHS、CHI 和F3H 以及来自非洲黑杨（Populus deltoides）的FLS 实现槲皮素的生物合成，滴度达到10 mg/L[29]。

由于槲皮素生物合成路径所必需的基因数量多，异源生物合成系统的效率低，因此微生物合成槲皮素产量较低。此外，异源合成途径中诸多的细胞色素P450 羟化酶都需要合适的P450 氧化还原酶（CPR）[30]作为还原配体，这也成为槲皮素异源合成的限速步骤之一。近年来，针对这一问题，在工程酵母中将拟南芥来源的C4H 和细胞色素P450 还原酶(ATR2) 配合使用，并过表达来自长春花（Catharanthus roseus）的CPR 和 矮 牵 牛（Petunia hybrida）的细胞色素P450 黄酮类单加氧酶(FMO)的融合蛋白CPR-FMO，可以提高类黄酮的生产代谢能力，使得槲皮素的产量达到20.38 mg/L[31]，这是目前微生物合成槲皮素的最高产量。微生物生物合成槲皮素产量的大幅提升为下一步槲皮素糖苷的生物合成奠定了基础。

1.2 UDP-sugars的供给

UDP-sugars 作为糖苷合成的糖基供体主要包括UDP-葡萄糖(UDPG)、UDP-鼠李糖(UDP-Rha)、UDP-半乳糖（UDP-Gal）、UDP-阿拉伯糖（UDPAra）、UDP-木糖（UDP-Xyl）、UDP-葡萄糖醛酸酯（UDP-GlcA）、UDP-N-乙酰氨基葡萄糖(UDPGlcNAc)。这些UDP-sugars 的生物合成相互关联，其中UDPG 是最重要的前体（图3）。在微生物中葡萄糖经过葡萄糖激酶磷酸化后形成葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)，经磷酸变位酶催化生成葡萄糖-1-磷酸(G-1-P)，其作为底物与等摩尔的尿苷三磷酸(UTP)在葡萄糖-1-尿苷转移酶的催化下形成UDPG[32-33]。UDPG 被UDP-葡萄糖-4-表异构酶催化形成UDP-半乳糖[34]，而经过UDPG 脱氢酶氧化形成UDP-葡萄糖醛酸酯[35-36]。UDP-葡萄糖醛酸酯经过脱羧反应形成UDP-木糖[34-35]，UDP-木糖经过UDP-木糖差向异构化合成UDP-阿拉伯糖[37]。UDP-N-乙酰氨基葡萄糖以G-6-P 为前体，通过己糖胺生物合成(HBS)途径合成[38]。UDP-鼠李糖广泛存在于植物中，以UDPG 为底物经鼠李糖合成酶（RHM）催化合成[39]。UDP-sugars作为生物代谢中的核心底物还被用于细胞壁的合成，氨基糖、核酸糖的代谢，以及微生物中次级代谢产物的合成。因此微生物内UDPsugars 供给不足是目前生物合成槲皮糖苷的关键问题之一。

1.3 糖基转移酶

糖基转移酶（GTs）可以将糖基供体上的糖基单元转移到苷元上，形成多种糖苷类化合物。GTs 作为一个庞大的酶家族，根据其氨基酸序列相似性、形成糖苷的立体化学结构和已知底物的特异性，被分为98个家族。其中1号GTs家族含有的糖基转移酶数量最多，且大部分成员在糖基化反应中以UDP-sugars 作为糖基转移体，因此又被称为尿苷二磷酸糖基转移酶（UGTs）。植物中繁杂的糖基转移酶可以特异性结合底物，从而产生不同的次级代谢产物。所有植物糖基转移酶中存在一个保守序列，即植物次生代谢特征序列（PSPG box），它是作为鉴定未知酶是否为糖基转移酶的参考依据[40-42]。

图3 UDP-sugars生物合成途径Fig.3 UDP-sugars biosynthesis pathway

Willits 等[43]最早在大肠杆菌中实现槲皮糖苷的合成。他们将拟南芥中的AtUGT73B2 克隆至大肠杆菌中，酶纯化后，以槲皮素为底物进行孵育，HPLC检测得到槲皮素-7-O-葡萄糖苷和槲皮素-3,7-O-双葡糖苷。在体内实验中，大肠杆菌过表达AtUGT73B2，体外饲喂槲皮素进行发酵，HPLC 检测同样得到与体外实验相同的产物。随后Lim 等[44]分析了拟南芥中91 种糖基转移酶的体外活性，发现AtUGT88A1 可以体外合成四种槲皮素单糖苷，分别是槲皮素-7-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3'-O-葡萄糖苷、槲皮素-4'-O-葡萄糖苷；AtUGT76E12 和AtUGT71C1 分别合成槲皮素-3,7-O-双葡糖苷和槲皮素-7,3'-O-双葡糖苷。利用大肠杆菌过表达拟南芥糖基转移酶并外加槲皮素作为底物，HPLC 检测可以发现AtUGT76E12 和AtUGT71C1 合成3-O-，7-O-，3'-O-，3,7-di-O-，7,3'-di-O-葡糖苷，AtUGT74F1 合成4'-O-葡萄糖苷。因为AtUGT73B3 在大肠杆菌体内实验中特异性合成单一产物槲皮素-3-O-葡萄糖苷且产量最高（8.96 mg/L），Lim 等[44]将表达AtUGT73B3 的大肠杆菌在发酵罐中进行培养，得到槲皮素-3-O-葡萄糖苷产量为99.3 mg/L，产率为10%。近几年通过对糖基转移酶的研究以及宿主内UDP-sugars 代谢路径的改造合成了多种槲皮素糖苷衍生物，表1 综述了各种槲皮素糖苷的生物合成。

2 槲皮素糖苷类衍生物的微生物合成

宿主内UDP-sugars 的供给以及糖基转移酶的选择对糖苷的生产至关重要。为提高工程菌株中糖基前体的供给，常用的策略包括过表达天然UDP-sugar 合成路径中的基因、敲除消耗UDPsugars 的非必需途径，以减弱天然代谢网络对UDPsugars 的调控。对不同来源糖基转移酶的筛选以及酶改造可以提高糖基转移酶对UDP-sugars 的亲和力从而提高糖苷的合成。

表1 槲皮素糖苷在大肠杆菌中的生物合成Table 1 Biosynthesis of quercetin glycosides in E.coli

2.1 糖基转移酶功能性改造

虽然有些UGT 具有广泛的底物特异性，但大部分糖基转移酶表现出糖供体和底物特异性[56-57]。例如来自植物的F7GAT 是一种类黄酮7-O-葡萄糖醛酸转移酶，其Arg350 与UDP-GlcA 葡糖醛酸部分的阴离子羧酸盐接近，Ser127 可能也与它的羧酸氧形成氢键。这两个氨基酸对于识别UDP- GlcA 至关重要[58]。红雏菊(Bellis perennis)中的BpUGT94B1 也是UDP-葡萄糖醛酸转移酶，其分子模拟表明，Arg25的长带正电荷侧链在葡萄糖醛酸C6位置的负电荷羧基附近延伸，与之相互作用，识别这种糖[59]。UDPG 中的葡萄糖部分主要与PSPG Box 中的最后两个残基谷氨酸和色氨酸相互作用，使2-，3-，4-OH 形成多个氢键。这些残基和区域是糖识别和结合的决定因素[15]。

由于还没有UGTs 被报道使用UDP-木糖作为糖供体，Han 等[60]利用模拟的UGT 进行分子对接实验，寻找对UDP-木糖亲和力高的糖基转移酶。AtUGT78D3（以UDP-Ara 为底物）由于其三维结构已被确定，所以被用于对接研究。AtUGT78D3 的His 380 会与UDP-木糖的磷酸相结合，这种结合导致槲皮素的3-羟基(糖附着位点)与UDP-木糖之间的距离为4.45 Å(1 Å=0.1 nm) [图4(a)]。这表明，UDP-木糖和槲皮素与AtUGT78D3 的结合可能是无效的。用Gln380 取代His380 后，槲皮素的3-羟基与UDP-木糖的距离为3.67 Å，因此AtUGT78D3(H380Q)使得UDP-木糖与槲皮素的结合更加紧密[图4(a)]。对接结果通过定点突变进行了验证，UGT78D3(H380Q)对UDP-木糖表现出明显的亲和力。通过过表达基因ugd，增强UDPG 到UDP-GlcA的转化，敲除UDP-葡萄糖醛酸C-4-脱羧酶(编码基因arnA)减少UDP-GlcA 的消耗[61]，最终得到槲皮素-3-O- 糖 150 mg/L[50]。 来 自 苜 蓿（Medicago truncatula）的糖基转移酶UGT71G1 通过酶工程[62]改造表明，UGT71G1 突变体F148V 和Y202A 显著改变了槲皮素糖基化的区域选择性[图4(b)]，从识别B 环的3'-O-位转为识别C 环的3-O-位，主要产生槲皮素3-O-葡萄糖[63-64]。

图4 糖基转移酶功能性改造范例Fig.4 Paradigms for functional modification of glycosyltransferases

结构域交换也是一种酶工程策略，可生成用于糖基化反应的糖基转移酶嵌合体。糖基转移酶的UGT74F1 和UGT74F2 通过交换结构域产生了嵌合体，该嵌合体改变了槲皮素上原有糖基化位点的偏好和特异性，产生了对槲皮素的4-OH 糖基化的新偏好，并且UGT74F1单个突变N142Y 也增加了对槲皮素4'-OH的催化选择性[65][图4(c)]。

2.2 UDP-sugars内源合成途径的优化

在大肠杆菌中合成槲皮素糖苷衍生物是目前的研究热点[66-67]。通过对大肠杆菌天然UDP-sugars代谢途径进行调控从而提高糖基前体的供给[68]。大肠杆菌中UDPG 的天然代谢路径是从外界摄取葡萄糖开始，经过葡萄糖激酶、磷酸变位酶和UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷转移酶得到UDPG。

Pandey 等[69]将来自皮诺卡氏菌(Nocardia farcinica)的葡萄糖磷酸变位酶（编码基因nfa44530）引入大肠杆菌，该酶催化从G-6-P 到G-1-P 的生化反应。将基因naf44530与galU融合过表达，提高了合成UDP-sugars重要前体UDPG的供给。而G-6-P是合成UDPG 的前体，在大肠杆菌中G-6-P 会被6-磷酸葡萄糖1-脱氢酶和磷酸葡糖异构酶分别转化为6-磷酸葡萄糖内酯(6-phosphogluconolactone)和果糖-6-磷酸（F-6-P）。利用碱基突变破坏染色体上的zwf和pgi基因，减少G-6-P 的消耗。同样的方法破坏UDPG 水解酶减少UDPG 的降解，同时过表达来自棘孢小单孢菌(Micromonospora echinosporasp.Calichenesis)的UDP-葡萄糖脱氢酶增加了UDPG 向UDP- GlcA 的碳通量。由于大肠杆菌中没有从UDP-GlcA 到UDP-Xyl 的天然代谢途径，通过引入棘孢小单孢菌的UDP-葡萄糖醛酸脱氢酶实现了大肠杆菌中UDP-Xyl 的生物合成(图5)。通过糖基转移酶AtGt3催化3-OH 的糖基化反应，最终实现了槲皮素-3-木糖的生物合成[49]。

相似的方法也用于槲皮素-3-葡糖苷酸的合成。Kim 等[51]通过过表达大肠杆菌内源基因ugd，敲除UDP-葡萄糖醛酸C-4 脱羧酶阻断UDP-GlcA 向UDP-戊酮糖的转化。经糖基转移酶VvUGT 催化，槲皮素-3-葡糖苷酸产量为687 mg/L(图5)。

2.3 UDP-sugars合成路径的正交化设计

大部分UDP-sugars 的合成依赖于G-6-P 至G-1-P 的生物转化，由于G-6-P 还会用于糖酵解和戊糖磷酸途径（PPP），因此G-6-P 的合成被认为是主要瓶颈[70]。因此有必要新建一条UDP-sugars 合成路径，该路径与宿主内源UDP-sugars 合成路径正交，分别用于糖苷合成和菌体生长。植物蔗糖合酶（sucrose synthase,SUS,EC 2.4.1.13）,以NDP-葡萄糖和果糖为底物催化合成蔗糖，同时，蔗糖合酶也可将蔗糖直接水解为果糖和UDPG，从而进行UDPsugars 的合成（图6）。Pei 等[48]通过将大豆蔗糖合酶(GmSUS)与UDP-葡萄糖-4-表异构酶偶联，合成UDP-半乳糖，通过对槲皮素具有高活性的矮牵牛糖基转移酶（PhUGT）合成槲皮素-3-半乳糖苷。糖基转移酶反应后会生成一分子UDP，UDP 在蔗糖合酶和UDP-葡萄糖-4-表异构酶催化下再生出UDPGal(图6)。这种UDP-sugars 再生系统不仅降低了所需的UDP-sugars底物成本，而且还避免了UDP对产物的抑制[16,71-72]。这一策略使得槲皮素-3-半乳糖苷的转化率达到92%，产物最终滴度为2134 mg/L[48]。

图5 大肠杆菌中UDP-sugars内源合成路径优化Fig.5 Optimization of UDP-sugars endogenous synthesis pathway in E.coli

图6 大肠杆菌中UDP-sugars合成路径的正交化设计Fig.6 Orthogonal design of UDP-sugars synthesis pathway in E.coli

另一种蔗糖代谢路径来自于双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)。将双歧杆菌蔗糖磷酸化酶(BaSP)引入大肠杆菌，蔗糖被分解为果糖和G-1-P，果糖用于生长目的，G-1-P 在尿苷转移酶（来自于双歧杆菌）催化下用于合成UDPG 的前体。为了防止G-1-P 转化为生物质前体，敲除了参与G-1-P 代谢的几种内源基因[73]，如pgm和葡萄糖-1-磷酸酶编码基因agp。通过敲除基因ushA和半乳糖操纵子有效地防止UDPG 的代谢（图6）。同时过表达拟南芥来源的鼠李糖合成酶（MUM4）保证了UDPRha 的供给[74]。引入拟南芥糖基转移酶(AtGt)最终槲皮素-3-鼠李糖苷的产量为1120 mg/L[47]。

3 展 望

以槲皮素为例，综述了微生物生产糖苷类化合物的合成策略。着重叙述了槲皮素的生物合成途径，所需的糖基转移酶，通过结构改造调整糖基转移酶的特异性，以及调控内源路径和引入正交化的UDP-sugars 合成路径来提升前体UDP-sugars 的供给等工程策略，实现菌体生长和糖苷合成之间的平衡。这些策略使微生物高产糖苷类化合物成为可能，但在实际生产中仍存在一系列挑战，如过表达酶的不溶性、工业放大中苷元转运以及廉价混合碳原的生物利用效率等。未来通过使用分子伴侣和助溶蛋白标签将会改善酶的可溶性表达，通过引入转运蛋白或调控细胞膜结构有望提高苷元的转运效率。

尽管大规模糖苷类生物合成还处于起步阶段，但随着代谢工程和合成生物学的发展，微生物在特定代谢产物的合成方面已经取得了许多进展。尤其是人工合成酵母的问世[75-76]，可以让人们更理性更高效地实现基因的大片段重组和优良底盘菌株的构建。随着人类对微生物体系越来越深入的认识，以及糖基化策略的不断改良，将会开启生物合成糖苷类化合物的新时代。