重组大肠杆菌表达17β-羟基类固醇脱氢酶全细胞催化合成宝丹酮的研究

吴玉玲，邵明龙，周武林，高惠芳，张显，徐美娟，杨套伟，饶志明

（江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡214122）

引 言

宝丹酮（boldenone，BD）是一种蛋白同化类固醇，可增加食欲，促进蛋白质合成，支持氮保留并刺激肾脏中促红细胞生成素的释放，多用于兽医和肉类生产行业[1]。在传统的类固醇制药行业中，宝丹酮主要由1,4-雄烯二酮（ADD）经过多步化学反应合成[2]。近年来，宝丹酮的生物方法合成以其温和的反应条件和环保优势引起了诸多关注。Chen 等[3]构建了重组P.pastorisGS115，实现了从雄烯二酮（AD）到ADD 和宝丹酮的生物转化，Eisa 等[1]发现Pseudomonas aeruginosa能以玉米油植物甾醇为底物，转化生成AD、睾酮和宝丹酮。Tang 等[4]通过重组M.neoaurum和P.pastoris的半连续发酵，以植物甾醇为底物，合成了ADD 和宝丹酮。但是由于转化率不高，存在副产物，或者转化过程复杂，对宝丹酮的生产造成一定的困难。

目前，已发现部分微生物含有17β-羟基类固醇脱氢酶（17β-HSD），可以催化类固醇的17β 还原反应。在体外，大多数17β-HSD 酶可以催化不同类固醇的17β 还原/氧化之间的可逆反应[5-10]（图1）。但是，不同来源的17β-HSD，在催化17β 位点的还原和氧化方向上具有不同的催化效率[8,11]，Fernández-Cabezón 等[12]将 来 源 于 睾 丸 酮 丛 毛 单 胞 菌（Comamonas testosteroni）和 月 状 旋 孢 腔 菌（Cochliobolus lunatus）的17β-HSD进行异源表达后，发现其具有C-17 还原活性，能以AD 为底物，催化其C-17 的C O 还原生成C—OH 的反应。但是由于转化率较低，限制了17β-HSD的工业应用。

图1 17β-羟基类固醇脱氢酶（17β-HSD）生物催化ADD合成BDFig.1 Bioconversion of ADD to BD by 17β-hydroxysteroid dehydrogenase(17β-HSD)

本研究将以此为基础，通过同源分析和序列比对，找到不同来源的17β-HSD，对其是否具有C-17还原活性进行分析，以期筛选到能催化ADD 还原生成宝丹酮的17β-HSD。

1 实验材料和方法

1.1 材料

1.1.1 基因、引物、质粒和菌株 本实验所用到的六个17β -HSD 基因分别来源于Cochliobolus lunatus,Pyrenochaetasp.,Beauveria bassiana,Arthroderma otae,Comamonas testosterone和Burkholderiasp.，经过大肠杆菌密码子优化后，由金唯智合成并连接到pUC57 质粒上，本实验所有的菌株、质粒和引物见表1。

1.1.2 主要试剂 ADD，宝丹酮标准样品购于上海Sigma-Aldrich；羟丙基-β-环糊精（HP-β-CD）购于山东滨州智源生物科技有限公司；DNA 聚合酶，T4 DNA 连接酶和限制性核酸内切酶购于大连宝生物生物工程有限公司；用于DNA 片段纯化和质粒提取的mini DNA 快速纯化试剂盒和质粒miniprep 试剂盒购于上海捷瑞生物工程有限公司。其他试剂为进口或国产分析纯及更高。

1.1.3 主要仪器 PCR 仪：德国Eppendorf 公司；UVP 凝胶成像仪：上海天能；核酸电泳系统：北京市六一仪器厂；蛋白电泳系统：美国Bio-Rad 公司；赛默飞U3000 高效液相色谱仪：美国赛默飞世尔科技有限公司。

1.1.4 培养基 LB液体培养基（g·L-1）：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10；LB 固体培养基（g·L-1）：在LB 液体培养基的基础上加2%的琼脂粉；根据具体情况添加抗生素，卡那霉素的工作浓度为20 μg·ml-1。

1.2 方法

1.2.1 重组质粒的构建 本实验所用到的质粒如表1，进行密码子优化后的17β-HSD 基因合成并克隆到了质粒pUC57-HSD 上。为了构建在大肠杆菌中表达的重组质粒，以不同的pUC57-HSD 质粒用作模板，将特异的-F(HSD)/-R(HSD)用作引物，并将获得的PCR 片段进行凝胶纯化后，用连接酶连接至pET-28a(+)载体的BamH Ⅰ/Hind Ⅲ限制性核酸内切酶位点。表1中显示了6种17β-HSD 基因的特异性-F(HSD)/-R(HSD)引物。然后将这些重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，以构建重组菌株BL21/pET28a-HSDCl、 BL21/pET28a-HSDPy、 BL21/pET28a-HSDBb、 BL21/pET28a-HSDAo、 BL21/pET28a-HSDCt 和BL21/pET28a-HSDBu，并 通 过DNA测序验证。

表1 本研究所用到的菌株、质粒及引物Table 1 Strains，plasmids and primers used in this study

1.2.2 17β-HSD 在大肠杆菌中的表达和纯化 将活化后的重组菌株BL21/pET28a-HSD 接种到50 ml LB，于37℃，200 r·min-1培养，当细胞在600 nm 的光密度（OD600）达到0.6～0.8 时，以0.5 mmol·L-1的终浓度添加IPTG 以诱导蛋白质表达。在25℃下继续培养12 h后，在4℃下以8000 r·min-1离心5 min收获细胞，并用10 ml 磷酸盐缓冲液（pH 7.5）洗涤3 次。然后将细胞重悬于5 ml 磷酸盐缓冲液中进行超声处理。超声处理后，以8000 r·min-1的速度离心30 min，从混合物中获得粗酶，并将其用于后续研究，包括纯化和十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）蛋白分析。以HisTrapTMHP 亲和层析柱[13]中所述的方法进行纯化，纯化后的蛋白用于酶活力测定和酶学性质分析。以Bradford 法和牛血清白蛋白为标准品测定蛋白浓度[14]。

1.2.3 17β-HSD 酶活性测定和酶学性质分析 用高效液相色谱法（HPLC）检测17β-HSD 活性，测量转化过程中宝丹酮的形成速率。反应体系（5 ml）含有50 mmol·L-1磷酸盐缓冲液（pH 7.5），200 μmol·L-1ADD（预溶于2%甲醇），0.5 mmol·L-1NADPH 和适当浓度的纯化酶。一个单位活性定义为在37℃和pH 7.5 下1 min 内能够将1 μmol·L-1ADD 转化为宝丹酮的17β-HSD 量。HSDPy 分别在不同pH（pH 4～6，50 mmol·L-1Na2HPO4-柠檬酸缓冲液；pH 6～8，50 mmol·L-1Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液；pH 8～10，50 mmol·L-1Na2CO3-NaHCO3缓冲液），不同温度（20～50℃，每隔5℃为一个梯度，以及37℃）以及不同金属离子和EDTA（在反应体系中分别添加K+、Na+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、Ni2+、Fe3+、Fe2+、Mg2+、EDTA，终浓度为1 mmol·L-1）条件下反应，以测定不同反应条件对HSDPy酶活性的影响。

1.2.4 重组菌株BL21/pET28a-HSD 对ADD 的全细胞转化 重组大肠杆菌BL21/pET28a-HSD 菌株在摇瓶中于37℃，200 r·min-1生长，在25℃诱导12 h后，将50 ml 培养物于8000 r·min-1离心5 min，并用50 mmol·L-1磷酸盐缓冲液（pH 7.5）洗涤三次以收获细胞。然后将细胞重悬（如不特殊说明，细胞干重23 g·L-1）于含有ADD（如不特殊说明，底物浓度为1 g·L-1）的50 ml 磷酸盐缓冲液（50 mmol·L-1，pH 7.5）中。细胞干重测量方法：取1 ml 细胞培养液，于13000 r·min-1，离心5 min 后去除上清液，于80℃下烘干，24 h后称量细胞干重。在以前的研究中，HPβ-CD 是ADD 生物转化的最佳助溶剂，ADD 与HPβ-CD 的最佳摩尔比为1∶1[15]。因此，本研究中使用了相同的比例添加助溶剂。对全细胞转化的不同生物量（9、18、27、36、45 g·L-1）和底物浓度（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g·L-1）进行了研究。在5 L 发酵罐中进行的全细胞转化的反应体系为2 L。于37℃，200 r·min-1条件下进行全细胞生物催化。从反应混合物中每隔一定时间取出1 ml 样品，经过乙酸乙酯充分萃取之后，用于HPLC分析。

1.2.5 分析方法 从反应液中取出1 ml 样品，将样品置于沸水浴10 min 终止反应，用4 ml 乙酸乙酯充分萃取。 离心后，取1 ml 上层溶液通过ThermoFisher HPLC 分析，色谱柱为Diamonsil C18（2），5 μm，250 mm×4.6 mm，检测器为紫外检测器。在254 nm 处检测到ADD 和宝丹酮，流动相由甲醇和水（70∶30,体积比）组成。流速为1 ml·min-1，柱温为30℃[16]。

2 实验结果与讨论

2.1 17β-羟基类固醇脱氢酶基因的筛选

在目前关于甾体17β-还原的研究中，发现了具有17β-还原活性的菌株，但是由于存在活性不高、缺乏对编码17β-HSD 基因的鉴定和对相应蛋白质的纯化和活性分析等问题[1,3,11,17-18]，限制了甾体药物的大规模生产。需要进一步丰富酶资源，以及选取合适的宿主进行表达，实现宝丹酮的经济高效合成[19]。以成功表达甾体17β还原活性的酶[12]为基础，根据其氨基酸序列，跨种属地在多种分枝杆菌、红球菌等宿主间，以及原核和真核生物间，进行了17β-HSD 序列的同源性分析和序列比对[20]，结果如图2所示。

由图可知，来源于Cochliobolus lunatus、Comamonas testosterone和Mycobacterium neoaurumVKM Ac-1815D 的17β-HSD 分别被分到三个独立的簇。对序列的结构域进行分析[21]，发现大多数17β-HSD 属于短链脱氢酶家族，具有一段辅因子结合特征序列TGXXXGXG 或TGXXGXXG 和活性位点特征序列YXXXK。分别选取了来源于真菌Cochliobolus lunatus（GenBank ID：AAR04485.1），Pyrenochaetasp.（GenBank ID：OAL44739.1，同源性96%） ，Beauveria bassiana（GenBank ID：XP_002844741.1，同 源 性 93%），Arthroderma otae（GenBank ID：XM_002844695.1，同源性80%）和来源 于 细 菌Comamonas testosterone（GenBank ID：CAA44977.1） ，Burkholderiasp. （GenBank ID：SIO70547.1，同源性48%）的六种不同17β-HSD，用于进行下一步研究。由于大肠杆菌表达系统具有遗传背景比较清楚、培养周期短、目标基因表达水平高等优势，将这六种不同17β-HSD 在大肠杆菌中进行了异源表达，以验证它们是否能够成功地表达生物学活性[22]。

图2 17β-HSD的同源性分析和序列比对Fig.2 Homology analysis and sequence alignment of 17β-HSD

2.2 重组17β-HSD的构建表达和活性分析

由于难以从天然来源直接获得高效表达17β-HSD 的菌株，因此尝试使用大肠杆菌作为表达宿主通过DNA 重组技术，异源过表达17β-HSD[23-25]。根据1.2.1 节中的方法，进行重组大肠杆菌BL21/pET28a-HSD 的构建，PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳，显示目的基因的条带大小约为820 bp，重组质粒经过BamH Ⅰ和Hind Ⅲ进行单双酶切验证，结果如图3 所示。由图可知，两个目的条带的大小分别约为5.40 kb 和820 bp，表明目的基因成功连接到pET28a(+)载体上，测序结果也表明各个重组pET28a-HSD质粒构建成功。

按照1.2.2 节所述的方法对重组蛋白进行诱导表达以及SDS-PAGE 分析，结果如图4 所示。由图可知，目的蛋白条带约在30×103处，与预期的目的17β-HSD 蛋白大小一致，可以初步确认各个17β-HSD在大肠杆菌BL21中实现了表达。

图3 重组质粒pET28a-HSD酶切验证Fig.3 Identification of recombinant pET28a-HSD by enzyme digestion

六种重组17β-HSD 在大肠杆菌中成功表达之后，为了进一步分析各种不同17β-HSD 在重组大肠杆菌中的活性，考察了各个重组BL21/pET28a-HSD对底物ADD 的转化情况，结果如表2。发现BL21/pET28a-HSDCl、 BL21/pET28a-HSDPy 和 BL21/pET28a-HSDBb 具有17β-还原催化的活性，在转化过程中生成了宝丹酮，其中BL21/pET28a-HSDPy 对ADD的转化率最高，在12 h内转化1 g·L-1ADD生成了0.72 g·L-1宝 丹 酮，比BL21/pET28a、BL21/pET28a-HSDCl、 BL21/pET28a-HSDBb、 BL21/pET28a-HSDAo、BL21/pET28a-HSDCt 和 BL21/pET28a-HSDBu 分 别 高 88.1%、24.3%、68.1%、86.0%、87.1%和87.5%。这些结果表明HSDPy 具有更高的催化潜力，因此对其酶学性质进行了进一步的研究。

2.3 重组酶HSDPy的酶学性质分析

图4 重组大肠杆菌17β-HSD SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of 17β-HSD expression in recombinant E.coli

表2 重组大肠杆菌BL21/pET28a-HSD转化ADDTable 2 Conversion of ADD by recombinant E.coli BL21/pET28a-HSD

图5 pH（a）和温度（b）对HSDPy酶活性的影响Fig.5 Effects of pH(a)and temperature(b)on activity of HSDPy

图6 不同金属离子及EDTA对HSDPy酶活性的影响Fig.6 Effect of different metal ions and EDTA on activity of HSDPy

将重组酶纯化后，按照1.2.3 节的方法，分析了HSDPy的最适pH、最适温度以及金属离子对其酶活性的影响。如图5、图6 所示，重组HSDPy 的最适反应pH 为7.5，在最适条件pH 下，将纯酶放置于不同的温度下进行反应，然后检测酶活性，以确定其最适反应温度。结果表明，随着反应温度升高，HSDPy的相对酶活也逐渐提高，在温度达到37℃时，重组酶的酶活力达到最高，然后随着温度的上升，酶活迅速下降。因此，可以确定重组HSDPy 在pH 为7.5条件下的最适反应温度为37℃。该重组酶的最佳pH 和温度与先前的研究一致[15]。在上述最适的反应pH 和温度的条件下，在反应体系中添加不同的金属离子和EDTA（终浓度为1 mmol·L-1），检测相应的酶活，其中Na+、K+和EDTA 对重组HSDPy 的酶活性影响较小，Mg2+、Mn2+、Ca2+、Ni2+、Fe2+使酶活显著降低，Fe3+、Zn2+使酶失活。

2.4 重组大肠杆菌BL21/pET28a-HSDPy 转化ADD生产宝丹酮

根据2.2 节的结果，经过6 株重组菌对ADD 的转化能力验证和比较后，确定了重组大肠杆菌BL21/pET28a-HSDPy 的催化活性最高，为了进一步提高宝丹酮的产量，对底物浓度、生物量等全细胞催化的条件进行了优化[15,26]。

生物量对生物转化具有重要影响，在转化过程中会影响底物的吸收和细胞的呼吸[27]。针对重组菌BL21/pET28a-HSDPy 不同生物量转化ADD 生成宝丹酮的研究结果如图7(a)所示。随着生物量的增加，宝丹酮的产量也逐渐增加，在生物量达到36 g·L-1时，达到最大值，对应宝丹酮的产量为0.85 g·L-1。当生物量大于36 g·L-1时，ADD 的转化率在12 h 内不再增加。转化率降低的原因可能是高密度细胞抑制细胞传质效率和细胞呼吸，进而降低了细胞对底物的利用。在重组大肠杆菌表达11β-羟基类固醇脱氢酶，催化氢化可的松合成为11β-氢化可的松的过程中，也出现了类似结果[28]。

由于ADD 难溶于水，在转化过程中会限制重组菌对底物的利用[29]，过量的底物对细胞有毒害作用，因此将ADD 转化为宝丹酮时需要在合适的底物浓度下进行。随着底物浓度的增加，ADD 的转化率逐渐增加，如图7(b)所示。底物浓度超过2 g·L-1后，宝丹酮的产量不再提高，表明底物浓度为2 g·L-1的条件下，已经达到了最大的底物利用率。之后底物浓度再升高，宝丹酮的产量反而降低，可能是由于高浓度底物对17β-HSD活性的抑制作用[30]。

在上述最佳条件下，将重组大肠杆菌BL21/pET28a-HSDPy 在5 L 发酵罐中进行了从ADD 到宝丹酮的转化。如图8(a)所示，生物转化12 h 后，从2 g·L-1ADD 中获得了1.46 g·L-1宝丹酮，在转化过程中未检测到副产物。由于大部分已鉴定的17β-HSD 可以催化可逆的氧化还原反应[6-7]，推测大肠杆菌BL21/pET28a-HSDPy 无法将ADD 完全转化为宝丹酮可能是因为存在可逆的反应。由于全细胞催化受到高浓度底物的限制，可以使用同一批生物催化剂通过分批补料策略来获得更高的宝丹酮产量。

图7 大肠杆菌BL21/pET28a-HSDPy的不同生物量（a）和不同底物浓度（b）对宝丹酮生产的影响Fig.7 Effects of different biomasses of E.coli BL21/pET28a-HSDPy(a)and substrate concentration(b)on BD production

图8 分批转化（a）和补料分批转化（b）ADD合成宝丹酮的过程Fig.8 Batch conversion(a)and fed-batch conversion(b)of ADD to synthesize BD

补料分批转化的结果如图8(b)所示。生物转化系统中ADD 的初始浓度为2 g·L-1，每12 h 将1.7 g·L-1ADD 补充到转化系统中，以使生物催化反应在最佳底物浓度的条件下继续进行。可以看出，在前两批反应中，宝丹酮的产量稳定增加。但是，在第三批转化过程中宝丹酮的生产率逐渐下降，这主要是由于高浓度产物的限制。在生物转化38 h 后，从5.40 g·L-1ADD 中获得了3.66 g·L-1宝丹酮，生产率为0.10 g·L-1·h-1，比优化之前（0.72 g·L-1、0.06 g·L-1·h-1）提高了60.5%，产量是优化之前的4.1倍。

总之，这些结果证明，通过补料分批策略对重组大肠杆菌BL21/pET28a-HSDPy 进行全细胞生物催化可以实现较高的宝丹酮产量。此外，与甾醇的发酵生产相比，本研究所提出的生物转化过程相对简单，不需要无菌环境并且从转化系统中纯化宝丹酮也相对简单。该研究为制药工业中宝丹酮的生产提供了有前景的生物转化系统和有效的方法。

3 结 论

本研究鉴定了来源于Pyrenochaetasp.的17β-HSD 具有较高的还原活性（对ADD 的转化率为72%），研究了其酶学性质（最适pH 为7.5，最适温度为37℃，以及除了Na+、K+，大部分金属离子会抑制其活性）。

在大肠杆菌中以ADD 为底物实现了宝丹酮的生物合成，并且通过全细胞转化条件优化（最佳转化生物量为36 g·L-1和最佳底物浓度为2 g·L-1），以及分批补料策略（初始底物浓度2 g·L-1，补料两次，共进行三批转化），使宝丹酮的产量由最初的0.72 g·L-1提高到3.66 g·L-1，产量提高了4.1 倍。另外，在转化过程中未检测到副产物。

后续研究可通过构建辅酶循环体系（例如共表达6-磷酸葡萄糖脱氢酶[15,31]，为反应提供可再生的还原力）进一步提升宝丹酮的产量。还可通过更换底盘细胞（如以酿酒酵母为底盘细胞[32-34]，利用葡萄糖为底物合成宝丹酮）进一步降低生产的成本。

本研究提供了一种在单次生物转化中获得宝丹酮的有效方法，为生物合成宝丹酮提供了可能。