重组大肠杆菌表达17β-羟基类固醇脱氢酶全细胞催化合成宝丹酮的研究

吴玉玲，邵明龙，周武林，高惠芳，张显，徐美娟，杨套伟，饶志明

（江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡214122）

引 言

宝丹酮（boldenone，BD）是一种蛋白同化类固醇，可增加食欲，促进蛋白质合成，支持氮保留并刺激肾脏中促红细胞生成素的释放，多用于兽医和肉类生产行业[1]。在传统的类固醇制药行业中，宝丹酮主要由1,4-雄烯二酮（ADD）经过多步化学反应合成[2]。近年来，宝丹酮的生物方法合成以其温和的反应条件和环保优势引起了诸多关注。Chen 等[3]构建了重组P.pastorisGS115，实现了从雄烯二酮（AD）到ADD 和宝丹酮的生物转化，Eisa 等[1]发现Pseudomonas aeruginosa能以玉米油植物甾醇为底物，转化生成AD、睾酮和宝丹酮。Tang 等[4]通过重组M.neoaurum和P.pastoris的半连续发酵，以植物甾醇为底物，合成了ADD 和宝丹酮。但是由于转化率不高，存在副产物，或者转化过程复杂，对宝丹酮的生产造成一定的困难。

目前，已发现部分微生物含有17β-羟基类固醇脱氢酶（17β-HSD），可以催化类固醇的17β 还原反应。在体外，大多数17β-HSD 酶可以催化不同类固醇的17β 还原/氧化之间的可逆反应[5-10]（图1）。但是，不同来源的17β-HSD，在催化17β 位点的还原和氧化方向上具有不同的催化效率[8,11]，Fernández-Cabezón 等[12]将 来 源 于 睾 丸 酮 丛 毛 单 胞 菌（Comamonas testosteroni）和 月 状 旋 孢 腔 菌（Cochliobolus lunatus）的17β-HSD进行异源表达后，发现其具有C-17 还原活性，能以AD 为底物，催化其C-17 的C O 还原生成C—OH 的反应。但是由于转化率较低，限制了17β-HSD的工业应用。

图1 17β-羟基类固醇脱氢酶（17β-HSD）生物催化ADD合成BDFig.1 Bioconversion of ADD to BD by 17β-hydroxysteroid dehydrogenase(17β-HSD)

本研究将以此为基础，通过同源分析和序列比对，找到不同来源的17β-HSD，对其是否具有C-17还原活性进行分析，以期筛选到能催化ADD 还原生成宝丹酮的17β-HSD。……