CRISPR/Cas9系统介导的人乳铁蛋白基因在山羊β-乳球蛋白基因座定点敲入

宋绍征 张 婷 潘生强 陆 睿 成 勇* 周鸣鸣*

(1.无锡太湖学院 护理学院， 江苏 无锡 214000；2.扬州大学 兽医学院/江苏省转基因动物制药工程研究中心，江苏 扬州 225009；3.江苏食品药品职业技术学院 制药工程学院，江苏 淮安 223003)

近年来牛乳过敏症体质者日渐增多[1]，因此研发改造不含致敏原的食用乳品至关重要。羊乳的成分更接近于人乳，可作为牛乳过敏体质者最理想的替代乳品[2]。研究表明山羊乳中β-乳球蛋白(β-lactoglobulin，BLG)是引起人体过敏反应的主要致敏原，且酶水解、加热和糖基化处理也很难消除其致敏性，反而会加重过敏反应[3-4]。人乳铁蛋白(Human lactoferrin，hLF)是最初在人乳汁中发现的一种铁结合蛋白，具有抑菌和杀菌、抗病毒、调节免疫、促进铁元素吸收等多种生物学功能，是十分理想的乳品添加剂[5]。因此，消除或降低羊乳中致敏原，同时增加功能营养蛋白成分，是提高羊乳品质的一个重要研究方向。

CRISPR/Cas9系统是一种成簇规律间隔短回文重复序列，由sgRNA引导Cas9核酸内切酶特异识别靶基因位点，切割使DNA双链断裂，再经同源重组和非同源末端连接两种途径进行修复[6]，是一种新型基因打靶技术，具有简单、高效、精准且易获得纯合子突变体等特点，被广泛地应用于转基因动物细胞和个体的基因组定点精确编辑和修饰[7-9]。通过CRISPR/Cas9系统介导的基因打靶技术，可以对山羊致敏原BLG基因敲除和营养成分hLF基因敲入，通过内源调控机制在乳腺中特异表达hLF而不表达BLG，实现羊乳的“人源化”改造，从而改善乳品质量：田雨晨等[10]利用CRISPR/Cas9系统对牛胎儿成纤维细胞β-酪蛋白基因进行编辑；……