液相色谱-质谱联用法同时测定大鼠血浆中色氨酸和犬尿氨酸

周资凯，郑柳，鲍益帆，杨丽，章志远

（1.南昌大学环境资源与化工学院，南昌 330031； 2.台州市台环环境检测科技有限公司，浙江台州 318020）

人体中的色氨酸和犬尿氨酸代谢途径已被证实与许多疾病和失调有相关联性，如人类免疫缺陷病毒的感染、亨廷顿病、阿尔茨海默病和精神分裂症［1-2］。色氨酸先经色氨酸-2，3-双加氧酶（tryptophan-2，3-dioxygenase，TDO）催化，再经吲哚胺-2，3-双加氧酶（indoleamine-2，3-dioxygenase，IDO）和犬尿氨酸甲酰胺酶氧化代谢为犬尿氨酸。研究表明，色氨酸存在于红肉类、乳制品和豆制品食物中，人体可从饮食或保健品中获取。色氨酸为人体多种重要生物活性分子的前驱物质，其代谢过程及代谢产物犬尿氨酸与多种疾病的发生有关，保持体内色氨酸的代谢平衡对人体健康有着重要意义，因此定量测定体内色氨酸及犬尿氨酸含量，对相关疾病的诊断治疗具有重要价值。

色氨酸和犬尿氨酸常用的分析方法是高效液相色谱法搭配不同的检测器，如紫外光检测器［3-5］、荧光检测器［6-7］、二极管阵列检测器［8-10］、电化学检测器［11-12］和串联质谱检测器等［13-18］。串联质谱法具有高灵敏和绝佳的选择性，是目前试验生物基质样品检测的首选。生物样本基质复杂，影响检测结果的准确度，常用的前处理方法有有机溶剂液相萃取［15，18］、固相萃取［12-14］、固相微萃取和液相微萃 取［19］等。为了提高灵敏度有时也进行衍生化液相微萃取［17］，但具有成本高，耗时长，样品损失多，选择性不佳和波峰分辨率不足甚至变形等缺点，不利于大量多通道样品的检测。

在药物动力学研究中，因某些药物代谢的研究需去除色氨酸以对比犬尿氨酸的变化，从而判断药物作用，这种方法需要对大量生物样本进行研究。此外，考虑到色氨酸在营养食品中的添加状况，需在低浓度线性范围测定，因此有必要建立较宽的检测范围和简便的净化提取方式。在利用LC-MS／MS法对人和大鼠血浆进行研究的文献报道中［13-18］，文 献［14］方法测定色胺酸、犬尿氨酸的浓度分别为0.018～0.282，0.017～0.276 μmol／L，可应用的测定范围有限；文献［18］方法测定色胺酸、犬尿氨酸的最低定量限分别为100，25 μg／L，残留基质会影响方法灵敏度。笔者建立液相色谱-质谱联用（LCMS）法同时测定和验证大鼠血浆中的色氨酸和犬尿氨酸，使用血液基质样本，因此更容易适用于其它基质（血清、尿液等）样品。该方法测定范围广，是一种快速、灵敏、简便的生化分析方法。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

液相色谱-质谱联用仪：6130 型，配有1200 G1329 自动进样器，1200 G1322A 真空装置，1200 G1311A 二元泵，1200 G1316A 进样和管柱温控装置，1200 MSD 单四级杆质谱检测器（G1948B 电喷雾离子源），04.01B 版化学工作站，美国安捷伦科技有限公司；

台式离心机：Allegra 6R 型，美国贝克曼库尔特有限公司；

色氨酸：纯度不小于99.0 %，西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；

犬尿氨酸：纯度不小于98.0 %，西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；

4-羟基-2-喹啉羧酸乙酯：纯度为96.0%，西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；

甲酸：ACS 级，纯度为98%～100%，西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；

活性碳：西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；

乙腈：色谱纯，纯度为99.9%，美国John Town send Baker；

甲醇：色谱纯，纯度为99.9%，美国Macron Fine Chemicals；

高氯酸：ACS 级，纯度为70.0 %，日本Showa Chemicals Industry；

去离子水：R≥18 MΩ，Milli-Q 纯水制造系统生产，美国默克密理博有限公司，用于制备所有溶液。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

色谱柱：Zorbax Eclipse XDB-C8 型（150 mm× 4.60 mm，5 μm，美国安捷伦科技有限公司）；流动相：A 相为0.20%甲酸水溶液，B 相为乙腈；梯度洗脱程序：0.00～0.50 min 为85% A，1.00～3.00 min 为45% A，3.60～5.00 min 为85% A；流量：1.20 mL／min；进样体积：10 μL。

1.2.2 质谱条件

离子源：电喷雾（ESI）；毛细管电压：3 000 eV；碎片电压：70.0 eV；干燥气体：氮气，流量为12.5 L／min；喷雾器压力：345 kPa；干燥温度：350℃；管柱温度：25℃；色氨酸、犬尿氨酸及EHQC 离子碎片特征离子：分别为205.1，209.1 和218.0m／z。

1.3 血浆样品前处理

收集大鼠血浆利用活性碳净化去除色氨酸。向1.00 mL 血浆中加入50.0 mg 活性碳混合，在室温下震荡0.5 h，然后以15 000 r／min 离心10.0 min，将上清液转移至干净微量离心管中，制成空白大鼠血浆于-80℃存放待用［20］。

取40.0 μL 上述空白大鼠血浆加入25%高氯酸10.0 μL，0.2%甲酸50.0μL（或标准品溶液）和200 μg／L 4-羟基-2-喹啉羧酸乙酯10.0μL，漩涡混合10.0 s，室温下以15 000 r／min 离心10.0 min，将上清液转移至干净微量离心管内待用。

1.4 溶液的配制

色氨酸和犬尿氨酸混合标准储备液：分别取适量色氨酸和犬尿氨酸，用0.2%甲酸溶液溶解，制备成质量浓度均为1.00 mg／mL 的混合标准储备液。

4-羟基-2-喹啉羧酸乙酯溶液：取适量4-羟基-2-喹啉羧酸乙酯，用甲醇-水（1∶100）混合液溶解制成质量浓度为10.0 mg／L 的4-羟基-2-喹啉羧酸乙酯溶液，然后稀释成质量浓度为200 μg／L 的溶液，作为内标溶液。

系列混合标准工作溶液：用空白大鼠血浆对色氨酸和犬尿氨酸混合标准储备液进行连续稀释，制成质量浓度均分别为0.500，1.00，5.00，10.0，50.0，100，500，1.00×103，5.00×103，1.00×104μg／L 的系列混合标准工作溶液。

质控样品：向空白大鼠血浆中加入适量已知浓度的色氨酸、犬尿氨酸混合标准储备液，制备成质量浓度均分别为2.00，40.0，80.0，800，8.00×103μg／L的质控样品。

1.5 稳定性考察

冻融循环稳定性：取5 组质控样品分别在4℃和-80℃下进行5 次冻融循环，然后进行测定，考察该条件下的稳定性。

室温稳定性：将配制好的质控样品分别在室温下保存3，6，9，12，15，36，48，60，72，84，96，108，120 h，然后进行测定，考察该条件下的稳定性。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理方法选择

生化样品常见的快速脱蛋白和去基质干扰的前处理方法是直接加入强酸、强碱或有机溶剂进行沉淀反应［10，12，17-18，20-21］，再剥离取上清液。研究发现这种方式会导致灵敏度降低，且选择性不足，以及色谱峰拖尾和滞留时间延长［15-16，18］。据文献［20］介绍，活性碳可吸附血浆中绝大部分生物基质。考察向1.00 mL 血浆样品中加入不同量（25.0，50.0 和75.0 mg）的活性炭，经过不同混合时间（0.5，1，2，4，6 和24 h）后进行测定。其中，混合24 h 与混合6 h的试验结果相比已无明显优化，因此不再考虑。其它条件下试验结果图1 所示。

由图1 可知，活性炭添加量为75.0 mg，混合时间为6 h 时纯化效果最佳，但是其色氨酸与LOD 比值与50 mg 混合0.5 h 差异不明显，对测定结果影响不大。考虑减少总耗时，并对后续分析无明显影响的原则，选择活性炭添加量为50 mg，混合时间为0.5 h。优化后的前处理可以获得较低的检出限和定量限，可快速，简便的获取大量优质纯化血浆样品。

图1 活性碳添加剂量与混合时间对空白血浆中色氨酸吸附的影响

在1.2 仪器工作条件下，对空白大鼠血浆样品进行测定并评估方法特异性，将空白血浆样品中色氨酸和犬尿氨酸的色谱峰面积与质量浓度为0.200 μg／L 的样品溶液对应的色谱峰面积进行比较，试验结果见表1。由表1 可知，空白血浆样品中测定的色谱峰面积仅为检出限试验样品对应色谱峰面积的6.43%（被测物含量小于检出限的20.0%），表明前处理方法对于色氨酸和犬尿氨酸具有有效特 异性。

表1 空白血浆与检出限试验样品色谱峰面积（n=6）

2.2 缓冲溶液的选择

为得到更好的分析物峰形，对同浓度下不同缓冲液（乙酸钠、硼酸钠、磷酸盐、乙酸铵和甲酸溶液）进行了平行试验。试验结果表明，使用0.2 %甲酸溶液可获得最佳分辨率和最尖锐的波峰，同时发现缓冲溶液中某些离子与分析物会发生较强的相互作用，导致色谱图出现宽峰，影响分离结果，而甲酸可有效增加分析物离子化程度［20］。综合上述条件，色氨酸和犬尿氨酸的测定滞留时间分别为2.71，2.07 min。大鼠血浆的质控样品色谱图如图2 所示。在优化好的最佳条件下，总分析时间小于4.00 min。

图2 大鼠血浆的质控样品色谱图

2.3 线性关系与检出限

在1.2 仪器条件下，对系列混合标准工作溶液进行分析，以待测物质量浓度（x）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，计算线性方程与相关系数R2。用全空白血浆（只加入4-羟基-2-喹啉羧酸乙酯）进行基质测定，以3 倍的标准偏差计算检出限，以10 倍的标准偏差计算定量限。线性范围、线性方程、相关系数、检出限、定量限列于表2。

表2 线性范围、相关系数、检出限、定量限

由表2 可知，待测物质的质量浓度在 0.500～ 1.00×104μg／L 的范围内与色谱峰面积线性关系良好，可应用于多数生物基质样本的分析。

据文献报道，测定色氨酸和犬尿氨酸的检出限分别为4.23～7.21，0.0250～3.60 μg／L，测定色氨酸和犬尿氨酸的定量限分别为8.46～500 和9.81～25.0 μg／L［12-17］，对比表3 可知，本方法灵敏度高，适合运用于生物基质样品中的分析检测

2.4 精密度试验

将净化好的血浆样品配制高中低3 种不同浓度进行测定，将样品按照优化后的条件进行试验，试验结果列于表3。由表3 可知，测定结果的相对标准偏差不大于4.7%，表明该方法测定色氨酸和犬尿氨酸精密度良好。

表3 大鼠血浆中分析物的精密度试验结果（n=5）

2.5 加标回收试验

以净化处理过的空白血液样品为基底进行加标回收试验，色氨酸和犬尿氨酸的平均回收率数据列于表4。由表4 可知，色氨酸和犬尿氨酸的平均回收率分别为99.2%～101%和100%～102%。结果表明该方法具有较好的准确度。

表4 大鼠血浆样品的绝对回收率（n=5）

2.6 稳定性考察

按1.6 方法对两种成分浓度均为2.00 μg／L的样品在4，-80℃下进行冻融循环稳定性试验，以及在室温120 h 内进行稳定性试验，结果列于表5和表6。由表5 和表6 可知，大鼠血浆样品在4℃和-80℃下冻融循环，以及室温120 h 内表现极为稳定，没有显著降解和其它变化，存储过程中使用不含或含极少量的有机溶剂，也能够有效帮助样品储备溶液长期保存，对复杂的生物基质样品前处理方法具有重要性。

表5 大鼠血浆样品冻融循环稳定性试验结果（n=5）

表6 大鼠血浆室温放置120 h 内样品稳定性试验结果（n=5）

3 结语

采用液相色谱-质谱联用法同时测定大鼠血浆中色氨酸和犬尿氨酸，优化了适用于复杂基质样品的前处理方法，有效地解决了生物基质对试验结果的影响。此方法可为药物动力学相关研究提供参考。与文献方法［13-18］相比，本方法可达到与文献报道的方法相同甚至更佳的结果，全过程几乎不需要有机溶剂或有毒溶液，污染小，废弃物少，相对更绿色环保，节省时间和经济成本，效益极高，样品溶液稳定性好。该净化方法和分析方法已成功应用于人类、小鼠、狗的血浆处理与分析。