马钱子水煎液对骨转移小鼠疼痛及骨转移灶中破骨细胞的影响

乔翠霞，张新峰，程旭锋，刘 琦，蔡小平*

（1.河南省中医药研究院，河南郑州 450004； 2.郑州大学附属肿瘤医院，河南郑州 450008； 3.河南中医药大学第一附属医院，河南郑州 450000； 4.河南中医药大学，河南郑州 450046）

据临床统计，中晚期恶性肿瘤患者发生骨转移高达70%左右，其中较为多见的肿瘤有晚期乳腺癌 （70%～80%）、中晚期前列腺癌 （70%～80%） 和晚期肺癌（10%～50%） 等［1-2］。肿瘤引起的骨转移，往往会破坏骨质，引发严重的骨不良事件，如难以忍受的骨痛、无诱因的发生病理性骨折、甚至脊髓压迫等，均会严重影响其生存质量，并给患者带来精神及肉体上的极大创伤，大大加重肿瘤患者的经济负担及口服止痛药物带来的副作用［3］。在我国，目前西医临床上针对恶性肿瘤发生明确的骨转移后定期行双磷酸盐治疗，合并局部微创手术、骨转移灶放疗、化疗等多种手段必要时采用配合治疗［4］。随着近年来，中医药在肿瘤探索治疗中的参与，中晚期肿瘤患者在发生骨转移后在选择西医疗法的同时，常伴随中医药辩证治疗贯穿始终，往往能一定程度的提高临床治疗骨转移的疗效。马钱子在中国古籍中记载具有镇痛作用，可用于骨关节疼痛疾病治疗［5-6］，有药理研究表明其活性成分具有抗肿瘤、促进骨损伤修复等作用［7-9］。本实验初步探讨马钱子治疗乳腺癌骨转移癌痛及骨质损伤的机制。

1 材料

1.1 动物及细胞株 SPF 级雌性BALB ／c 小鼠共32 只，4周龄，体质量（18±2） g，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，生产许可证号SCXK （沪） 2013-0016。人乳腺癌骨高转移细胞MDA-MB-231BO，美国德克萨斯州立大学医学系Toshiyuki Yoneda 博士惠赠。

1.2 药物 称取马钱子3.9 g，首先加入双蒸水750 mL，药物充分浸泡2 h，武火煮沸30 min，将药液过滤，得第1次滤液；然后将药渣再加双蒸水500 mL，进行武火煮沸30 min，再次将药液过滤，得第2 次滤液；最后将2 次药物的滤液合并在一起，采用80 ℃恒温水浴，浓缩至500 mL，最终制成7.8 mg 生药／mL，进行灭菌后，将制备好的马钱子药液放置于4 ℃冰箱保存备用。

1.3 试剂 戊巴比妥钠（批号p3761） 购自美国Sigma 公司；唑来膦酸注射液（4 mg／支，批号H20041346） 购自江苏省正大天晴药业集团股份有限公司；注射器 （批号1306230） 购自美国BD 公司；75% 乙醇（批号20160130）购自郑州吉尔康消毒制品有限公司。

1.4 仪器 医学图像采集系统购自日本奥林巴斯株式会社；倒置显微镜购自日本Nikon 株式会社；Von Frey 细纤维购自美国North Coast Medical 公司；BME-410C 自动热痛刺激仪购自天津伯尔尼科技有限公司；十万分之一电子天平购自瑞士Mettler-Toledo 公司。

2 方法

2.1 造模及给药 乳腺癌小鼠骨转移癌痛模型的建立参考文献［10］方法，采用0.4% 戊巴比妥钠将各组小鼠麻醉后，仰卧，75%乙醇对左后肢皮肤进行消毒，在胫骨上部切一长约0.5 cm 的切口，充分暴露左胫骨内侧面，在膝关节下方约5 mm 处沿胫骨长轴，然后用23G 一次性无菌注射器针头进行打孔，针头进入骨髓腔，然后换上30 μL注射器进入股骨骨髓腔，下一步缓慢注入20 μL 乳腺癌骨高转移细胞MDA-MB-231BO 细胞（1.0×107／mL），注射完毕后用骨蜡封堵针孔，然后将肌肉和皮肤逐层缝合。假手术组采用同样的方法在胫骨注入等体积的生理盐水。将小鼠随机分成假手术组、模型组、马钱子组、唑来膦酸组，每组8 只。各组于术后第4 天开始给药［11］，假手术组、模型组和唑来膦酸组均给予0.2 mL 双蒸水灌胃，马钱子组给予78 mg／kg 马钱子煎液灌胃，1 次／d，连续4 周；唑来膦酸组腹腔注射唑来膦酸0.2 mg／kg［12］，假手术组、模型组和马钱子组均进行腹腔注射生理盐水0.5 mL，连续4 周，3次／周。

2.2 各组小鼠机械性痛觉超敏检测 采用小鼠机械性痛觉超敏法［13］。在治疗前后分别用2 g Von Frey 纤维刺激各组小鼠左后足底部，5～6 s 后观察各组小鼠缩足反应，记录缩足次数。每只小鼠进行实验5 次，每2 次实验必须间隔3 min。缩足反应率＝ ［（缩足次数／5）］×100%。

2.3 各组小鼠热刺激痛觉过敏检测 分别于治疗前后评估小鼠热刺激痛觉过敏［13］情况。将调节热板仪温度设置为（50±1）℃，然后将各组小鼠分别放置于热板上，观察各组小鼠的反应，立即计时至小鼠开始舔左后足时的时间，每次间隔15 min，每只测3 次，其均值为该小鼠的热刺激痛阈值。

2.4 各组小鼠Micro-CT 检测 按照前期报道［12］进行。各组小鼠采用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，分别取出左后胫骨，沿胫骨长轴方向扫描胫骨近端，采用Micro-CT 扫描，扫描角度360 °、分辨率10 μm，获取医学显微CT （μ-CT）图像；在主机上选取生长板下1 mm 和胫骨近端1.5 mm 的区域为敏感区域（ROI），进行三维图像重建，最后采用机载软件分析骨矿物质密度（BMD）、骨体积（BV）、选取感兴趣区域（ROI） 体积（TV），计算相对骨体积或骨体积分数BV／TV。

2.5 各组骨转移灶TRAP 染色观察 按照前期报道［11-12］进行。取各组小鼠骨转移灶组织，采用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，行病理切片，TRAP 染色，观察破骨细胞形态，并记录TRAP 阳性细胞数量。

2.6 统计学分析 采用SPSS 17.0 统计软件，计量资料以（） 表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 各组小鼠缩足反应百分率比较 与假手术组比较，模型组治疗前、后小鼠缩足反应百分率均升高（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组比较，唑来膦酸组、马钱子组治疗后小鼠缩足反应百分率均降低（P＜0.05，P＜0.01），而其治疗前差异无统计学意义（P＞0.05）；与治疗前比较，模型组治疗后小鼠缩足反应百分率升高（P＜0.01），唑来膦酸组、马钱子组治疗后小鼠缩足反应百分率均降低（P＜0.05）。见表1。

表1 各组小鼠缩足反应百分率比较（， n＝8）

表1 各组小鼠缩足反应百分率比较（， n＝8）

注：与假手术组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01；与模型组比较，△△P＜0.01；与治疗前比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

3.2 各组小鼠热刺激痛阈值比较 与假手术组比较，模型组治疗前、后小鼠热刺激痛阈值均降低（P＜0.01）；与模型组比较，唑来膦酸组、马钱子组治疗后小鼠热刺激痛阈值均升高（P＜0.01）；与治疗前比较，唑来膦酸组、马钱子组治疗后均升高（P＜0.05，P＜0.01）。见表2。

表2 各组小鼠热刺激痛阈值比较（， n＝8）

表2 各组小鼠热刺激痛阈值比较（， n＝8）

注：与假手术组比较，**P＜0.01；与模型组比较，△△P＜0.01；与治疗前比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

3.3 各组小鼠左后胫骨转移灶骨质破坏情况 Micro-CT 扫描发现，假手术组小鼠无明显骨质破坏；其余各组均存在一定程度的骨质破坏，BV／TV 值降低，BMD 下降；与假手术组比较，模型组骨质破坏严重，BMD、BV／TV 值均下降（P＜0.01）；与模型组比较，唑来膦酸组、马钱子组小鼠骨质破坏均有所减轻，BMD 和BV／TV 值均升高（P＜0.01）。见图1、表3。

图1 各组小鼠左胫骨三维Micro-CT 扫描图

表3 各组小鼠BMD、BV／TV 比较（， n＝8）

表3 各组小鼠BMD、BV／TV 比较（， n＝8）

注：与假手术组比较，**P＜0.01；与模型组比较，△△P＜0.01。

3.4 各组小鼠骨转移灶中TRAP （＋） 细胞数量比较 与假手术组比较，模型组TRAP （＋） 细胞数量增加 （P＜0.01）；与模型组比较，唑来膦酸组、马钱子组TRAP （＋）细胞数量均减少（P＜0.01），见表4。

表4 各组小鼠骨转移灶中TRAP （＋） 细胞数量（，n＝8）

表4 各组小鼠骨转移灶中TRAP （＋） 细胞数量（，n＝8）

注：与假手术组比较，**P＜0.01；与模型组比较，△△P＜0.01。

4 讨论

中医古籍里并无关于的肿瘤骨转移病名记载，但就其症状可散见于中医“胫阴疽”“骨蚀”“肉瘤”“石榴疽”“骨瘤”“骨痹”等范畴。早在《五十二病方》 已有骨睢（疽） 的记载。《素问·长刺节论》：“病在骨，骨重不可举，骨髓酸痛，寒气至名曰骨痹”，《华佗神医秘传》 记载骨质肿瘤的临床表现，“肿不变色，漫肿疼痛，坚硬如石”，《医宗金鉴》：“骨痹，则骨重酸疼不能举也”，均是对骨转移肿瘤特点的描述。本课题组认为骨转移日久可出现疼痛，成因与发展，主要在于阳虚、痰凝两个方面。其病机不外乎“不通则痛”“不荣则痛”。多为正气亏虚，癌毒内生所致。“癌毒”多为痰凝日久凝聚于骨的结果。痰浊随气升降，流注脏腑经络，运动周身，无处不到，外而皮肉筋骨，痰浊与癌毒互结而成痰毒，痰毒流注于骨而形成骨转移瘤，使经络壅塞不通、痰阻血瘀，从而引起机体疼痛；而痰瘀癌毒互结，耗伤正气，皆可导致顽固、持久之癌痛。

正如《证治要诀》 云：“痛则不通，通则不痛”，肿瘤骨转移患者往往因为痰浊流注血脉、经络，阻碍气血津液的运行受阻而产生骨骼疼痛。

中药马钱子具有舒筋活血、散寒通络、化痰散结、止痛的功效，针对痰毒流注病机，可多种原因导致的骨关节疾病的治疗［5-6，14-15］。清代王维德在《外科全生集》 中谓马钱子能“搜筋骨入骱之风湿，祛皮里膜外凝结之痰毒”。张锡纯在《医学衷中参西录》 中指出马钱子具有“开通经络，透达关节之力，远胜它药”。现代药理研究也证实马钱子可用于多种恶性肿瘤及疼痛的防治［7-8，16-17］。

机械性痛觉超敏、热刺激痛觉过敏是目前评价生理性疼痛程度的主要评价指标。本实验结果显示，与模型组治疗后及本组治疗前比较，马钱子组治疗后小鼠缩足反应百分率均明显升高，而热刺激痛阈值均明显降低，提示马钱子能抑制乳腺癌骨转移小鼠触诱发痛和热刺激痛觉过敏，说明马钱子具有缓解骨转移癌痛的作用。进一步通过micro-CT 对各组小鼠的骨转移灶进行扫描提示，模型组小鼠骨转移灶的BV／TV 值偏低，BMD 下降，提示骨转移灶中存在一定程度的骨质流失，该结果与前期报道一致［11，13］，马钱子可使小鼠骨转移组织BV／TV 值及BMD 升高，提示其对骨转移灶的骨质流失具有一定的抑制作用。骨代谢依赖于破骨细胞介导骨吸收和成骨细胞介导骨形成的动态平衡，破骨细胞活性的相对增加可导致骨质流失。TRAP 是破骨细胞的特征性酶，本实验中模型组骨转移灶中TRAP （＋） 细胞明显增多，提示骨转移发生后破骨细胞过度激活，该结果与前期报道一致［11，13］，马钱子组TRAP （＋） 细胞数量较模型组均明显减少，提示马钱子对破骨细胞具有一定的抑制作用。

综上所述，马钱子可以缓解骨转移小鼠癌痛，其机理可能与其能抑制骨转移灶中破骨细胞的活性，减少骨质流失有关。