红花黄色素对糖尿病大鼠神经传导速度的影响

何万辉 简小兵王文英赵志祥李慧枝*

（1.广州中医药大学，广东广州 510504； 2.广州医科大学附属中医医院，广东广州 510130）

糖尿病周围神经病变（diabetic peripheral neuropathy，DPN） 是糖尿病最常见的慢性并发症之一，可导致糖尿病患者足部痛觉、温度觉异常或缺失，因而成为患者发生足部溃疡的最常见的危险因素［1］。氧化应激 （Oxidative stress，OS） 是糖尿病各并发症发生的共同病理生理机制，在包括DPN 在内的多种糖尿病并发症的发病过程中起重要作用［2］。神经生长因子（Nerve Growth Factor，NGF） 是神经营养因子家族成员之一，也是最早被发现、具有抗细胞凋亡、促进神经生长和分化等多重生物学功能的神经细胞生长调节因子［3-6］，其水平下降与DPN 发生、发展存在密切关系［7-8］。

既往研究发现注射用红花黄色素能改善DPN 患者临床症状［9-10］。但注射用红花黄色素对DPN 的具体作用机制未明，本研究根据糖尿病大鼠坐骨神经传导速度和NGF 水平探讨注射用红花黄色素对DPN 的防治作用及其机制。

1 材料

1.1 动物 SPF 级雄性SD 大鼠60 只，体质量180～220 g，购自中山大学实验动物中心东校园，实验动物生产许可证号SCXK（粤） 2016-0029，使用许可证号SYXK（粤） 2016-0112。

1.2 试剂与药物 注射用红花黄色素（浙江永宁药业股份有限公司，国药准字Z20050146，批号1905213）；甲钴胺注射液 ［卫材 （中国） 药业有限公司，国药准字J20070063，批号101271］。链脲佐菌素（美国Sigma 公司，批号050401）；SOD ELISA 试剂盒（美国Biovision 公司，批号E4584-100）；MDA ELISA 试剂盒（北京安迪华泰科技有限公司，批号AD190124）；NGF ELISA 试剂盒（北京安迪华泰科技有限公司，批号AD190128）；TRizol ［宝日医生物技术（北京） 有限公司］；RevertAid cDNA 逆转录试剂盒（美国Thermo 公司）；SYBR Green qPCR Kit （日本Toyobo 公司）；DEPC （美国Pierce 公司）。

1.3 仪器 多功能酶标仪 （美国Tecan 公司）；Nanodrop2000 紫外微量分光光度计（美国Thermo 公司）；Mastercycler pro 梯度PCR 仪（德国Eppendorf 公司）；LigthCycler480 荧光定量PCR 仪（瑞士Roche 公司）；BL-420S 生物机能实验系统（成都泰盟科技有限公司）；稳豪倍优型血糖仪（OneTouchR UltraVue，美国强生公司）。

2 方法

2.1 造模 60 只SPF 级SD 大鼠在自然光线、自由饮食条件下适应性喂养7 d。正常组不造模，自由饮食、普通饲料喂养，其余3 组高脂饲料喂养2 个月后以链脲佐菌素造模，临用前以0.1 mmol／L 枸橼酸缓冲液（pH ＝4.2，4 ℃） 在避光条件下配成2%溶液。大鼠于高脂饲料喂养第61 天禁食12 h，左下腹腔单次注射链脲佐菌素（50 mg／kg），72 h后取尾静脉血测随机血糖，≥16.7 mmol／L 者为糖尿病造模成功。大鼠自由饮食7 d，第8 天测定坐骨神经运动神经传导速度（Motor Conduction Velocity，MCV），较造模前下降≥10%为DPN 大鼠模型。

2.2 分组及给药 分为正常组、模型组、给药组、阳性对照组，每组10 只。正常组和模型组大鼠每日自由饮食，不予任何干预；阳性对照组大鼠腹腔注射甲钴胺注射液（250 μg／kg），1 次／d；给药组大鼠腹腔注射红花黄色素（40 mg／kg，溶于0.9%氯化钠注射液中），1 次／d。造模成功后于第1～28 天给药，干预4 周。

2.3 血糖测定 大鼠尾静脉采血，应用稳豪倍优型血糖仪及稳豪试纸检测。

2.4 坐骨神经神经传导速度测定 使用BL-420S 生物机能实验系统。大鼠腹腔注射水合氯醛（35 mg／kg） 麻醉，俯卧位固定，将刺激双针电极置于大鼠右侧坐骨切迹处坐骨神经传出部位，于同侧踝关节坐骨神经经过部位用双针电极记录，参考电极置于刺激电极与记录电极之间、距记录电极1 cm 处。用波宽1 ms 的单刺激，延时10 000 ms，每2 个刺激之间间隔5 s 以上，记录复合动作电位的峰-峰值作为波幅值，严格控制室温（20±0.5） ℃，保持动物体温37 ℃。计算机记录刺激开始到动作电位出现的时间，即潜伏时间，将大鼠后足以自然肢体状态与脊柱成45 °夹角向斜后方拉直，沿坐骨神经经过部位和方向，在体表准确测定刺激电极到记录电极之间的距离。MCV ＝刺激电极与记录电极间的距离／潜伏时间。

2.5 血清相关指标测定 采用ELISA 法。把SOD、MDA、NGF 抗体包被在96 孔微孔板里，做成固相载体，朝微孔中分别加入标准品或标本，其中SOD、MDA、NGF 与结合于固相载体上的抗体结合，然后加入生物素化的SOD、MDA抗体，把未结合的生物素化抗体洗净，再加入HRP 标记的亲和素，再彻底洗漆1 次后加入TMB 底物显色；TMB 在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并且在酸的作用下转化为最终的黄色，其深浅与SOD、MDA、NGF 呈正相关。酶标仪检测450 nm 波长处光密度（OD），计算因子水平，具体操作根据试剂盒说明书严格执行。

2.6 RT-PCR 检测坐骨神经组织NGFmRNA 表达 取大鼠坐骨神经（长度不小于5 mm），以液氮研磨组织粉末，氯仿-异丙醇法提取总RNA，琼脂糖凝胶电泳检测RNA 纯度和有无降解。按照逆转录试剂盒操作合成cDNA。以cDNA为模板，按照ABI Prism 7000 实时定量PCR 仪操作规程检测，进行扩增，检测mRNA 表达用仪器配套的SDS1.1 软件分析，内参选择GAPDH。引物序列：NGF正向5′-CAACAGGACTCACAGGAGCAAGC-3′，反向 5′-GATGTCCGTGGCTGTGGTCTTATC -3′；GAPDH正向 5′-AGTGCCAGCCTCGTCTCATA-3′，反向 5′-TGAACTTGCCGTGGGTAGAG-3′。每个样本、指标重复3 次。

2.7 统计学分析 采用SPSS 15.0 软件进行处理，数据以（） 表示，满足正态性和方差齐性，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD 检验；不满足正态分布，采用Wilcoxon 秩和检验。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 红花黄色素对DPN 大鼠坐骨神经MCV 的影响 在药物干预前与正常组比较，DPN 大鼠MCV 降低（P＜0.05）。在药物干预后，模型组MCV 较正常组下降（P＜0.01）；与模型组比较，红花黄色素给药组大鼠MCV 升高（P＜0.01），提示注射用红花黄色素可能具有延缓DPN 大鼠MCV 下降的作用，见表1。

表1 红花黄色素对DPN 大鼠坐骨神经MCV 的影响（m／s，， n＝10）

表1 红花黄色素对DPN 大鼠坐骨神经MCV 的影响（m／s，， n＝10）

注：与正常组比较，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01；与模型组比较，＃＃P＜0.01。

3.2 红花黄色素对DPN 大鼠SOD、MDA、NGF 的影响DPN 大鼠SOD 水平低于正常大鼠（P＜0.01），MDA 水平高于正常大鼠（P＜0.01），提示DPN 的发生、发展与氧化应激有关。与模型组比较，给药组及阳性对照组SOD、NGF 水平升高，MDA 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），见表2。与正常组比较，模型组NGFmRNA 表达降低 （P＜0.01）；与模型组比较，给药组NGFmRNA 表达升高（P＜0.01），见图1。

表2 红花黄色素对DPN 大鼠血清SOD、MDA、NGF 水平的影响（， n＝10）

表2 红花黄色素对DPN 大鼠血清SOD、MDA、NGF 水平的影响（， n＝10）

注：与正常组比较，▲▲P＜0.01；与模型组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

4 讨论

DPN 与OS 关系密切，国外内的研究均发现DPN 患者体内的MDA 显著升高、SOD 显著下降［11-12］，提示DPN 的发生、发展与SOD 水平下降、MDA 水平上升有关。OS 可导致雪旺细胞损伤［13-14］，从而引起内源性NGF 合成和分泌障碍。NGF 表达下降与DPN 的发生和发展存在密切联系。

图1 红花黄色素对DPN 大鼠坐骨神经组织NGF mRNA表达的影响

糖尿病的临床表现为口干多饮、多食易饥、多尿、消瘦，属中医学“消渴病”范畴。DPN 的临床表现为肢体麻木、疼痛、冰凉、乏力等各种感觉异常，属于中医学“痹症”范畴。由于其与消渴病关系密切，是患消渴病日久、病情迁延所致的“变证”，故现代中医学将DPN 称为“消渴病痹症”。消渴病痹症之候轻者表现为肢端麻木不仁，重者表现为痛如针刺、痛有定处，其特点与瘀血内生、经络不通所致之疼痛特点相符。因此，运用中医药治疗DPN应以活血化瘀为基本治法。中药红花首载于《新修本草》，性温，味辛，具活血通经、祛瘀止痛之功［15］。注射用红花黄色素是红花的主要活性成分［16］。既往研究发现红花黄色素具有扩张动脉、抗凝、抗氧化等作用［17-19］。

本研究发现，接受注射用红花黄色素腹腔注射4 周后，糖尿病大鼠坐骨神经MCV 有上升，但与给药前对比，差异未存在统计学意义，未能证实注射用红花黄色素具有逆转高血糖引起神经功能损伤。但在干预后，给药组MCV 优于模型组，提示注射用红花黄色素能延缓DPN 进展。本研究发现注射用红花黄色素具有抗氧化应激、上调NGF 表达的作用；与模型组相比，注射用红花黄色素组SOD、NGF 水平升高。本研究结果显示，红花黄色素可减轻高血糖引起的氧化应激，延缓神经组织中NGF 表达下降，从而发挥保护神经组织的作用。