UPLC-MS／MS 法分析通奶草乙酸乙酯部位成分及其体外抗菌活性

林启凰，鲍红娟，张 岗*

（1.厦门医学院，厦门市海洋天然产物资源重点实验室，福建厦门 361023； 2.厦门医学院闽台青草药研究室，福建厦门 361023）

大戟科大戟属植物是被子植物的一个庞大家族，全世界有2 000 种以上［1］，《中国植物志》 记载该属植物有80种［2］，部分是临床上常见中药，如大戟、狼毒、甘遂、飞扬草等，在民间应用也十分普遍，具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗炎等药理活性［3］。通奶草Euphorbia hypericifoliaL.为大戟属聚生花序组植物［4］，广泛分布于我国长江以南各省，具有清热利湿、收敛止痒的功效［3］，可用于治疗腹泻及瘙痒性皮肤病，主要含有黄酮、鞣花酸、三萜、甾体类物质［5］，但其药理活性评价未见报道。课题组前期发现，通奶草乙酸乙酯萃取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌有一定的抑制作用，为了进一步发掘其药用价值，本实验利用超高效液相色谱-串联质谱联用技术（UPLC-MS／MS） 对其乙酸乙酯萃取物成分进行分析，共鉴定出21 种，包括3 种有机酸、8 种可水解鞣质、10 种黄酮，除鞣花酸和槲皮素外均为首次从该植物中鉴定。

1 材料

ACQUITY UPLC H-Class 超高效液相色谱仪［Waters 科技（上海） 有限公司］；Q Exactive Focus 组合型四极杆Orbitrap 质谱仪（美国赛默飞世尔科技公司）；Diaion MCI树脂（日本三菱化学公司）。没食子酸、鞣花酸、异槲皮苷、木犀草苷、紫云英苷、槲皮素对照品均购自成都瑞芬思生物科技有限公司；瑞诺苷、番石榴苷、juglalin 对照品均购自成都普利斯生物科技有限公司；金丝桃苷［6］、柯里拉京［7］、老鹳草素［7］对照品为实验室自制。MH 琼脂培养基（北京陆桥技术有限责任公司）；MH 液体培养基（广东环凯生物科技有限公司）；金黄色葡萄球菌、大肠杆菌标准菌株由厦门医学院病原微生物与免疫学实验室提供；氨苄青霉素、诺氟沙星药敏纸片（杭州微生物试剂有限公司）。药材于2018 年10 月采自福建厦门市灌口镇，经厦门医学院药学系鲍红娟副教授鉴定为大戟科大戟属植物通奶草Euphorbia hypericifoliaL.的地上部分。

2 方法

2.1 样品溶液制备 取通奶草地上部分50 g （干重） 粉碎成粗粉，分别用10 倍量75%甲醇加热回流提取2 次，每次2 h，滤过，合并提取液，减压浓缩至无醇味，加入适量水混旋后，依次用等量的石油醚、乙酸乙酯各萃取3 次，合并萃取液，减压蒸干得总萃取物（2.5 g），取适量过MCI树脂，90%甲醇洗脱，收集洗脱液，减压干燥，适量甲醇溶解，即得（1 mg／mL）。

2.2 色谱条件 Agilent Eclipse Plus C18色谱柱（100 mm×4.6 mm，3.5 μm）；柱温25 ℃；流动相乙腈（A） -0.1%甲酸（B），梯度洗脱 （0～50 min，5%～30% B；50～51 min，30%～100%B；51～57 min，100%～100%B；体积流量0.4 mL／min；全波长扫描；进样量2.5 μL。

2.3 质谱条件 电喷雾电离源负离子检测模式，辅助气体积流量5 L／min；喷雾电压2.00 kV；离子传输管温度320 ℃；扫描模式Full MS／dd-MS2，m／z100～1 500；二级质谱碰撞能量-30 eV。

2.4 抗菌实验

2.4.1 抑菌圈测定［8］取金黄色葡萄球菌、大肠杆菌标准菌株（-80 ℃超低温保存），活化后挑取单菌落接种于100 mL MH 肉汤培养基中，37 ℃下摇瓶培养24 h，最后将菌液调整至约1.5×108CFU／mL 的含菌量。

金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的阳性对照品分别为氨苄青霉素、诺氟沙星药敏纸片，空白对照为甲醇和活化菌液。将各活化菌液用灭菌棉签均匀铺于MH 琼脂培养基板上，用镊子夹取直径6 mm 的无菌滤纸片放在平板中，贴紧MH固体培养基表面，吸取2 mg／mL 样品溶液10 μL 滴于滤纸上，阳性药敏纸片同法贴于培养基表面，待甲醇挥干后密封，于37 ℃培养箱中静置24 h 后观察。

2.4.2 最小抑菌浓度测定［9］采用96 孔板法，每孔培养体系为200 μL，含有MH 液体培养液180 μL、不同质量浓度的待测样品10 μL、菌液10 μL。测试前配制样品溶液，并稀释成2、1.8、1.6、1.4、1、0.8 mg／mL。用空白培养基和甲醇溶液作对照，吸取稀释好的待测样品10 μL，置于已加入180 μL 培养液的96 孔板中，加入菌液10 μL，密封，于37 ℃培养箱中静置24 h 后观察并计算MIC 值。

公式为MIC （μg／mL） ＝ （V1×C×1 000） ／V2，其中V1为待测样品体积（μL），V2为体系总体积（μL），C为使培养液澄清的最低待测溶液质量浓度（mg／mL）。

3 结果

经预实验结合同属植物化学成分报道，推断通奶草主要成分可能为酚类，故采用负离子模式采集总离子流数据，结果见图1、表1。根据离子流出峰的相对保留时间、准分子离子的精确质荷比、碎片离子信息，同时参照文献数据，最终鉴定出21 种成分，包括3 种有机酸、8 种可水解鞣质、10 种黄酮，结合相关对照品信息，鉴定了没食子酸（1）、柯里拉京（5）、老鹳草素（6）、鞣花酸（11）、金丝桃苷（12）、异槲皮苷（13）、木犀草苷（14）、瑞诺苷（15）、番石榴苷（16）、紫云英苷（17）、juglalin （20）、槲皮素（21），除鞣花酸和槲皮素外均首次从该植物中鉴定。体外抗菌实验显示，通奶草乙酸乙酯萃取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有一定的的抑制作用。具体如下。

图1 通奶草乙酸乙酯萃取部位负离子检测模式下总离子流图

3.1 化合物鉴定

3.1.1 没食子酸类 化合物1 （tR＝6.00 min） 的准分子离子峰为m／z169.013 3 ［M-H］-，根据元素组成，推测分子式为C7H6O5，二级碎片离子m／z125.023 1 ［M-H-CO2］-是由为分子中失去一个质子和一个中性碎片CO2产生，根据对照品的相关信息，鉴定化合物1 为没食子酸。化合物2 （tR＝18.05 min） 的准分子离子峰为m／z183.029 1 ［MH］-，根据元素组成，推测分子式为C8H8O5，二级碎片离子m／z168.005 4 ［M-H-·CH3］-是由为分子中失去1 个质子和1 个甲基自由基·CH3产生，初步鉴定化合物2 为没食子酸甲酯［10］。

3.1.2 没食子酸鞣质 化合物3、7、10 的二级质谱均有m／z169 ［M-H］-特征信号，且为基峰，提示分子中均有没食子酰基；其碎片离子在准分子离子峰基础上连续失去没食子酰基 （-galloyl，152 u）［11］，也可能失去中性碎片H2O。以化合物10 （tR＝33.92 min） 为例，准分子离子峰为m／z787.100 1 ［M-H］-，根据元素组成，推测分子式C34H28O22，二级质谱显示了635.090 8 ［M-H-galloyl］-、617.080 9 ［M-H-galloyl-H2O］-、483.078 0 ［M-H-2galloyl］-、465.067 3 ［M-H-2galloyl-H2O］-、169.013 2［GA］-等特征碎片离子信息，根据文献［12］鉴定为四没食子酰基葡萄糖苷。同理，化合物3 （tR＝24.43 min）、7（tR＝28.41 min） 的准分子离子峰分别为m／z635.089 9、635.089 7 ［M-H］-，根据碎片离子信息和文献［12］鉴定均为三没食子酰基葡萄糖苷（同分异构体）。

3.1.3 鞣花酸及鞣花鞣质 化合物11 （tR＝34.80 min）的准分子离子峰为m／z300.998 8 ［M-H］-，根据元素组成，推测分子式为C14H6O8，特征碎片离子有m／z283.305 4［M-H-H2O］-、257.008 5 ［M-H-CO2］-。根据碎片离子和对照品的相关信息，鉴定为鞣花酸。

化合物4～6、8～9 鉴定为鞣花鞣质，分子中均有六羟基联苯二甲酸结构，二级质谱均出现m／z301 ［M-H］-［13］，且为基峰，其碎片离子可能失去没食子酰基或中性碎片H2O。该类化合物另一个典型特征是一级质谱上易见［M-2H］2-峰［14］。以化合物5 （tR＝26.60 min）、6 （tR＝27.11 min） 为例，化合物5 准分子离子峰为m／z633.074 5［M-H］-，根据元素组成，推测分子式C27H22O18，二级质谱显示了615.063 0 ［M-H-H2O］-、463.051 9 ［M-Hgalloyl-H2O］-、300.999 3 ［ellagic acid］-、169.013 4［GA］-等特征性碎片离子信息，根据文献［15］并结合对照品质谱和色谱信息，鉴定为柯里拉京；化合物6 准分子离子峰为m／z951.076 2 ［M-H］-，根据元素组成，推测分子式C41H28O27，二级质谱显示了475.034 1 ［M-2H］2-特征性碎片离子，以及933.064 6 ［M-H-H2O］-、933.053 1 ［M-HH2O］-、475.034 1 ［M-2H］2-、300.999 1 ［ellagic acid］-、169.012 9 ［GA］-等特征性碎片离子信息，根据文献［15］结合对照品质谱和色谱信息，鉴定为老鹳［12］草素。同理，

鉴定化合物4、8、9 分别为chebulanin［16］、digalloyl-HHDPglucose、chebulagic acid［12］。

表1 通奶草乙酸乙酯部位化学成分鉴定

3.2 黄酮类化合物鉴定

3.2.1 槲皮素类 负离子模式下，黄酮醇苷的ESI 串联质谱中易形成［M-H］-分子离子峰，脱去糖基形成苷元离子［Y0］-，也可以均裂方式形成［Y0-H］-·自由基负离子［17］，后者在3-O 取代黄酮中极易形成［18］。化合物12～13、15～16 鉴定为以槲皮素为母核的黄酮苷，二级质谱均显示了槲皮素母核的特征信号为m／z301 为 ［Y0］-，m／z300 为［Y0-H］-·，后者为基峰，说明可能为3-O取代黄酮苷；m／z271 为［Y0-H2CO］-碎片离子，m／z151 为RDA 裂解产生的碎片离子。化合物12 （tR＝35.18 min） 准分子离子峰为m／z463.088 5 ［M-H］-，与苷元m／z301 相比少了一个己醛糖基，推断3-O上连有己醛糖；化合物13 （tR＝35.91 min）准分子离子峰为m／z463.088 4 ［M-H］-，与苷元m／z301相比少了一个己醛糖基，推断3-O上也连有己醛糖，根据对照品的相对保留时间和质谱信息，鉴定12 为槲皮素-3-Oβ-吡喃半乳糖苷，即金丝桃苷；13 为槲皮素-3-O-β-吡喃葡萄糖苷，即异槲皮苷。化合物15 （tR＝37.46 min） 准分子离子峰为m／z433.077 8 ［M-H］-，与苷元m／z301 相比少了一个戊醛糖基，推断3-O上连有戊醛糖；16 （tR＝38.31 min） 准分子离子峰为m／z433.077 6 ［M-H］-，与苷元m／z301 相比少了一个戊醛糖基，推断3-O上也连有戊醛糖，根据对照品的相对保留时间和质谱信息，鉴定化合物15 为槲皮素-3-O-β-D-吡喃木糖苷，即瑞诺苷；16 为槲皮素-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷，即番石榴苷。根据准分子离子峰、碎片离子和对照品信息，鉴定化合物21 （tR＝53.39 min） 为槲皮素。

3.2.2 山柰酚类 化合物17、19～20 鉴定为以山柰酚为母核的黄酮苷，二级质谱均显示其特征信号为m／z285 为［Y0］-，m／z284 为［Y0-H］-·，后者为基峰，说明可能为3-O取代黄酮苷；m／z255 为［Y0-H2CO］-碎片离子，m／z151 为RDA 裂解产生的碎片离子。化合物17 （tR＝39.86 min） 准分子离子峰为m／z447.093 5 ［M-H］-，与苷元m／z285 相比少了一个己醛糖基，推断3-O上连有己醛糖，根据对照品的相对保留时间和质谱信息，鉴定为山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷，即紫云英苷。化合物19 （tR＝41.50 min） 和20 （tR＝42.43 min） 为同分异构体，准分子离子峰均为m／z417 ［M-H］-，与苷元m／z285 相比均少了一个戊醛糖基，推断3-O上连有戊醛糖，根据对照品相对保留时间和质谱信息，鉴定20 为山柰酚-3-O-α-阿拉伯糖苷，即juglalin；根据同属植物化学成分报道和相对保留时间［19-20］，初步鉴定19 为山柰酚-3-O-β-D-吡喃木糖苷。

3.2.3 其他黄酮 在实验条件下，未实现化合物14 （tR＝35.98 min） 与15 的色谱分离，一级质谱上显示了m／z447.093 5 ［M-H］-准分子离子峰，与化合物17 互为同分异构体，但却显示了与17 不同的质谱数据。表1 显示，基峰m／z285 为［Y0］-，提示黄酮分子3 位氢未被取代，可能为木犀草素母核，此外还显示了m／z327.050 8 的碎片离子峰，与文献［21］报道一致。结合对照品信息，鉴定化合物14 为木犀草苷。化合物18 （tR＝40.90 min） 准分子离子峰为m／z417.083 5 ［M-H］-，根据元素组成推测分子式为C21H20O10，碎片离子显示了m／z269 ［Y0］-的芹菜素母核信息，初步鉴定为芹菜素-7-O-β-吡喃葡萄糖苷［21］。

3.3 抗菌活性 结果见图2。在质量浓度为2 mg／mL时，通奶草乙酸乙酯提取物对金黄色葡萄球菌抑菌圈直径为（9±0.2） mm ［阳性对照为（31±0.2） mm］，见图2A；对大肠杆菌为（8±0.3） mm ［阳性对照为（30±0.3） mm］，见图2B；MIC 值分别为90、100 μg／mL，表明萃取物对两者具有一定的抑制作用。

图2 通奶草乙酸乙酯萃取物抗菌活性实验

4 讨论

LC-MS／MS 联用技术用于复杂天然成分分析，具有快速、高效、灵敏等特点［22］，是研究中草药等天然药物的有力工具。本研究采用UPLC-MS／MS 联用技术，结合对照品对照，鉴定了通奶草乙酸乙酯萃取物的21 种成分，以可水解鞣质和黄酮类化合物为主，基本阐明通奶草乙酸乙酯萃取部位的成分组成。通奶草中所含化合物类型及种类与同属植物地锦草［19］及同科植物乌桕［23］等相似，表明同科特别是同属植物之间的化学成分存在共性，这对于开发药用资源具有重要意义。本研究所鉴定的诸多化合物具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗病原微生物、降血糖等多种生物活性，对于揭示通奶草药效物质基础具有一定意义。没食子酸对早幼粒细胞白血病（HL-60RG）、人胃癌细胞（KATOⅢ）和结肠腺癌细胞（COLO 205） 均有抑制作用［24］；老鹳草素对单纯疱疹病毒（HSV-1 和HSV-2） 具有显著抑制活性［25］；鞣花酸对CCl4诱导的小鼠急性肝损伤具有保护作用，其作用机制可能与抗炎和抗氧化有关［26］；金丝桃苷能有效抑制COX-2 蛋白表达，逆转炎症因子对肝细胞造成的损伤，进而保护肝细胞［27］；异槲皮苷（15 mg／kg） 可显著降低四氧嘧啶升高的血糖浓度，其机制与6-葡萄糖磷脂酶活性抑制以及抗氧化清除自由基密切相关［28］，这些文献报道为通奶草的临床应用提供了理论依据。同时，乙酸乙酯萃取物对2 种常见的革兰氏致病菌有一定的抑菌作用，对后续的研究有一定的借鉴意义。