白术须根和主根的质量差异

邵志愿廖延武吴德玲 金传山黄 琪张 伟

（1.安徽中医药大学药学院，安徽合肥 230012； 2.安徽省现代中药重点实验室，安徽合肥 230012；3.中药饮片制造新技术安徽省重点实验室，安徽亳州 236816）

白术为菊科植物白术Atractylodes macrocephalaKoidz.的干燥根茎，性味苦、甘、温，无毒，归脾、胃经，具有健脾益气、燥湿利水、止汗、安胎的功效，临床上用于脾虛食少、腹胀泄泻、痰饮眩悸、水肿、自汗、胎动不安［1］等症，目前相关复方制剂已有543 种，平均年需求量约为7 000 吨。经过产地调研发现，白术须根较发达，产地加工过程中其数量占总采收量的10%左右，但按传统加工方法它为非药用部分需去除，不仅耗费人力物力，也造成资源浪费，不利于中药资源可持续发展。现代药理研究表明，白术有效活性成分主要是挥发油，白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，白术多糖等［2］，白术内酯Ⅰ具有较强的增强唾液淀粉酶活性、促进肠管吸收、调节肠道功能的作用，是白术健脾运脾的有效成分［3-4］，也具有抗肿瘤作用［5］；白术内酯Ⅱ能显著抑制Lovo 细胞的増殖并诱导其发生调亡，其分子机制与调节PARP1、caspase-3 的表达相关［6］；白术内酯Ⅰ和白术内酯Ⅲ可以抑制MAPK和NF-κB 的活化［7］，并均具有抗炎活性［7-8］；白术多糖可促进小肠上皮细胞迁移，对应激性溃疡有防治作用，能通过多胺介导信号通路促进细胞迁移，其作用机制与多胺介导的钙离子通道及Ca2＋作用机制相关［9］；白术多糖、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅲ可以作为免疫调节剂来调节免疫系统，提升免疫力［10］。前期发现，白术须根和主根中挥发油、内酯类、白术多糖等活性成分含有量丰富，其中白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ亦是特征性成分。本实验以白术须根和主根为研究对象，通过多成分含有量测定和多指标分析来探究两者质量差异，以期为药材资源再利用提供依据。

1 材料

1.1 仪器 日立天美PM1000 液相色谱仪［天美（中国） 科学仪器有限公司］；DFY-300 （摇摆式）多功能高速粉碎机 （温州顶历医疗器械有限公司）；FA2004 型电子天平（十万分之一，德国Sartorius 公司）；MSA6 型电子天平（百万分之一，北京赛多利斯仪器系统有限公司）；TU-1810 紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）；HHS111-2 型电热恒温水浴锅（北京长安科学仪器厂）；AS5150A 型超声清洗仪（加拿大Autoscience公司）。

1.2 试剂与药物 白术内酯Ⅰ（批号73069-13-3）、白术内酯Ⅱ（批号73069-14-4）、白术内酯Ⅲ（批号73030-71-4） 对照品均购于武汉天植生物科技有限公司，纯度均≥98%；D-无水葡萄糖对照品（批号17042604） 购于成都普菲德生物科技有限公司，纯度≥98%。色谱纯甲醇、乙腈（美国Fisher公司）；无水乙醇、苯酚、磷酸、浓硫酸等均为分析纯；水为娃哈哈纯净水。

1.3 药材 白术主根和须根采自湖南、河南、河北、浙江、安徽、北京同仁堂（亳州） 饮片有限公司白术标准化种植基地（亳州基地），经安徽中医药大学刘守金教授鉴定为菊科植物白术Atractylodes macrocephalaKoidz.的干燥主根及须根。具体见表1。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

2 方法与结果

2.1 浸出物含有量测定 按2015 年版《中国药典》 第四部2201 醇溶性浸出物测定法项下的热浸法，用60%乙醇作为溶剂进行测定。

2.2 挥发油含有量测定 按2015 年版《中国药典》 第四部2204 挥发油测定项下的甲法进行测定。

2.3 白术多糖含有量测定

2.3.1 苯酚试液制备 称取苯酚100 g，加铝片0.10 g、碳酸氢钠0.05 g，油浴中常压蒸馏，收集182 ℃的馏分，取馏出液5 g，放入100 mL 棕色量瓶，加纯净水定容至刻度，摇匀，即得。

2.3.2 对照品溶液制备 精密称取D-无水葡萄糖对照品13.12 mg，置于100 mL 量瓶中，加纯净水稀释至刻度，摇匀，配成0.131 2 mg／mL，即得。

2.3.3 供试品溶液制备 精密称取药材粉末0.20 g，无水乙醇索氏提取2 h，残渣挥去溶剂，加50 mL 水回流2 h，抽滤，得滤液，精密移取10 mL 至50 mL 量瓶中，定容，摇匀，即得。

2.3.4 吸光度测定 精密吸取供试品、对照品溶液各0.50 mL 于10 mL 具塞试管中，补加水至1 mL，加5%苯酚1 mL、浓硫酸5 mL，摇匀，放置5 min 后水浴加热10 min，放冷，同法用纯净水作为空白，在484 nm 波长处测吸光度。

2.3.5 线性关系考察 精密移取对照品溶液0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mL 于10 mL具塞试管中，分别加入0.90、0.80、0.70、0.60、0.50、0.40 mL 纯净水稀释成1.87、3.75、5.62、7.50、9.37、11.24 μg／mL，每管再加入5%苯酚溶液1 mL，迅速滴加浓硫酸5 mL，立即摇匀，放置5 min，置沸水浴中加热10 min，迅速冷却至室温，同法以1 mL 蒸馏水为空白对照，于484 nm 波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标（A），葡萄糖质量浓度为横坐标（X） 进行回归，得方程为A＝0.060 6X＋0.053 7 （r＝0.999 1），在1.87～11.24 μg／mL 范围内线性关系良好。

2.3.6 精密度试验 精密吸取对照品溶液，按“2.3.4”项下方法进行测定，以纯净水为空白对照，在484 nm 波长处测定吸光度6 次，测得白术多糖含有量RSD 为0.46%，表明仪器精密度良好。

2.3.7 稳定性试验 精密吸取供试品溶液，按“2.3.4”项下方法进行测定，以纯净水为空白对照，在484 nm 波长处测定吸光度，每隔1 h 进行1次，连续5 h，测得白术多糖含有量RSD 为1.50%，表明溶液在5 h 内稳定性良好。

2.3.8 重复性试验 取同一份药材，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液6 份，按“2.3.4”项下方法进行测定，以纯净水为空白对照，在484 nm波长处测定吸光度，测得白术多糖含有量RSD 为1.60%，表明该方法重复性良好。

2.3.9 加样回收率试验 精密称取白术多糖含有量已知的药材（S1） 粉末6 份，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，加入适量对照品溶液，按“2.3.4”项下方法进行测定，计算回收率，结果见表2。

表2 白术多糖加样回收率试验结果（n＝6）Tab.2 Results of recovery tests for A.macrocephala polysaccharide （n＝6）

2.3.10 含有量测定 白术须根、主根供试品溶液按“2.3.3”项下方法制备，含有量按 “2.3.4”项下方法测定，结果以干燥品计。

2.4 白术内酯Ⅰ、Ⅲ、Ⅱ含有量测定

2.4.1 白术内酯Ⅰ、Ⅲ色谱条件 Waters XBridge C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈-0.02%磷酸（47∶53）；柱温30 ℃；体积流量1.0 mL／min；检测波长220 nm；进样量20 μL。色谱图见图1。

图1 白术内酯Ⅰ、ⅢHPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of atractylenolidesⅠand Ⅲ

2.4.2 白术内酯Ⅱ色谱条件 Waters XBridge C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相甲醇-0.02% 磷酸 （75∶25）；柱温25 ℃；体积流量0.8 mL／min；检测波长276 nm；进样量20 μL。色谱图见图2。

2.4.3 对照品溶液制备 精密称取白术内酯Ⅰ、Ⅲ对照品适量，甲醇制成分别含两者0.140 0、0.164 0 mg／mL 的溶液。同理，甲醇制成含0.134 4 mg／mL白术内酯Ⅱ的溶液。

2.4.4 供试品溶液制备 取药材粉末（过60 目筛） 约1 g，精密称定，置于25 mL 量瓶中，加甲醇适量，超声（400 W、40 kHz） 处理40 min，放冷，定容，摇匀，滤过，取续滤液，过0.45 μm微孔滤膜，即得。

图2 白术内酯ⅡHPLC 色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of atractylenolide Ⅱ

2.4.5 线性关系考察 取上述对照品溶液各5 mL，按2、4、8、16、32、64 倍依次稀释，吸取白术内酯Ⅰ、Ⅲ溶液，在“2.4.1”项色谱条件下进样；吸取白术内酯Ⅱ溶液，在“2.4.2”项色谱条件下进样。以溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y） 进行回归，得白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ回归方程分别为Y＝84 464X-6 426.8（r＝0.999 9）、Y＝126 257X＋127 054（r＝0.999 9）、Y＝56 654X＋16 552 （r＝ 0.999 9），分别在0.002 2～0.070 0、0.004 2～0.134 4、0.002 5～0.082 0 mg／mL 范围内线性关系良好。

2.4.6 精密度试验 精密吸取各对照品溶液20 μL，在“2.4.1”项色谱条件下进样6 次，测定白术内酯Ⅰ、Ⅲ峰面积；同理，在“2.4.2”项色谱条件下测定白术内酯Ⅱ峰面积。结果，三者峰面积RSD 分别为1.12%、1.08%、1.31%，表明仪9 器精密度良好。

2.4.7 稳定性试验 取同一供试品溶液，于0、4、8、12、20、24 h 进样20 μL，在“2.4.1”项色谱条件下测定白术内酯Ⅰ、Ⅲ峰面积，在“2.4.2”项色谱条件下测定白术内酯Ⅱ峰面积。结果，三者峰面积RSD 分别为1.21%、1.16%、1.28%，表明溶液在12 h 内稳定性良好。

2.4.8 重复性试验 取同一批须根6 份，按“2.4.4”项下方法制备6 份供试品溶液，各取20 μL，在“2.4.1”“2.4.2”项色谱条件下进样测定，测得三者含有量RSD 分别为1.01%、1.26%、1.32%，表明该方法重复性良好。

2.4.9 加样回收率试验 精密称取含有量已知的药材（S1） 粉末6 份，精密加入适量对照品溶液，按 “2.4.4”项下方法制备供试品溶液，在“2.4.1”“2.4.2”项色谱条件进样测定，计算回收率，结果见表3。

表3 白术内酯加样回收率试验结果（n＝6）Tab.3 Results of recovery tests for atractylenolides （n＝6）

2.4.10 样品含有量测定 按“2.4.4”项下方法制备供试品溶液，在“2.4.1”“2.4.2”项色谱条件下进样测定，计算含有量，结果见表4。

表4 各成分含有量测定结果（%）Tab.4 Results of content determination of various constituents （%）

3 讨论

3.1 条件优化 本实验曾尝试以HPLC 法同时测定白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ含有量，但发现白术内酯Ⅰ、Ⅲ最佳吸收波长为220 nm，白术内酯Ⅱ为276 nm；也曾尝试双波长切换法，发现白术内酯Ⅰ、Ⅲ以乙腈-0.02%磷酸（47∶53） 洗脱时可获得较好的分离效果，分析时间也适中，但其分离白术内酯Ⅱ效果不佳，最终选择甲醇-0.02% 磷酸（75∶25），可以达到较好的分离效果。由于白术内酯含有量相对较低，考察提取方式时曾尝试甲醇回流提取、索氏提取、超声提取、乙酸乙酯提取等，发现甲醇超声提取效果最佳。

3.2 各成分转化关系 白术须根中挥发油含有量高于主根中，60% 左右的成分是苍术酮［11］，它先与氧自由基结合，再经过重排、转位形成自由基中间体，然后接受质子自由基形成白术内酯Ⅰ，或两分子间偶联生成双白术内酯，或进一步氧化形成白术内酯Ⅲ［12］，加热后脱水生成了白术内酯Ⅱ［13］。白术须根中白术内酯Ⅱ、Ⅲ平均含有量分别为0.044 5%、0.056 7 %，高于主根中的0.036 9 %、0.035 0 %，但无统计学差异（P＞0.05），可能与白术内酯Ⅱ、Ⅲ相互转化有关；白术内酯Ⅰ含有量有统计学差异（P＜0.01），须根中低于主根中。

3.3 各成分对白术须根和主根的影响 将表4 中所有数据导入SMICA14.1 软件进行无监督主成分分析，通过帕累托缩放与平均定心后，对所有的数据进行降维，见图3。由此可知，须根和主根明显分别聚类，且须根之间的差异性明显小于须根与主根之间，表明两者在主成分上不同。

图3 52 批样品主成分分析图Fig.3 Principal component analysis plot for fifty-two batches of samples

将白术须根作为一组，主根作为另一组进行OPLS-DA 分析，在帕累托缩放和平均定心后，所有数据都显示在分数潜变量坐标系中，见图4。

图4 各样品S-plot 分析图Fig.4 S-plot analysis of various samples

在S-Plot 图中处于两端离散程度较大的成分对样品差异贡献最大。由此可知，白术多糖、浸出物、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ对白术主根差异有影响，其中白术多糖贡献值最大；挥发油、白术内酯Ⅰ对白术须根差异有影响，其中挥发油贡献值最大。为了进一步确定差异性成分，将各成分含有量依据贡献值重新进行整合，见图5。

图5 各样品VIP 分析图Fig.5 VIP analysis of various samples

由此可知，差异性成分贡献值依次为挥发油＞白术多糖＞白术内酯Ⅰ＞浸出物＞白术内酯Ⅱ＞白术内酯Ⅲ，取大于1 的作为质量标志性成分。结果显示，挥发油可作为白术须根质量标志性成分，白术多糖、白术内酯Ⅰ可作为白术主根质量标志性成分，白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ可作为两者共同质量标志性成分。

3.4 展望 苍术酮是白术主要燥性成分［13］，而白术内酯Ⅰ是其健脾物质之一［3］。白术经炮制后，苍术酮转化为白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ等内酯类成分，燥性缓和，健脾作用增强［14］。白术须根具有丰富的苍术酮，但白术内酯Ⅰ含有量较低，推测它可能有燥湿利水、止汗等功效。本研究以白术须根、主根成分含有量测定结果为基础，讨论了前者再利用的可能性，为节约药材资源、保护生态环境、提高利用率提供了依据。