尿石素A 对2 型糖尿病小鼠脂肪组织胰岛素抵抗的影响

杨 柳，田亚丽，古丽海夏哈勒玛合拜，巴合提别克，张 燕，张䶮之*

（1.新疆医科大学，新疆乌鲁木齐 830011； 2.新疆医科大学药学院药理教研室，新疆乌鲁木齐 830011；3.新疆医科大学一附院，国家高发病重点实验室，新疆乌鲁木齐 830011； 4.新疆军区乌鲁木齐总医院，新疆乌鲁木齐 830002）

胰岛素抵抗（insulin resistance，IR） 作为2 型糖尿病的主要发病基础，越来越受到重视。脂肪组织是胰岛素的靶器官，也是内分泌器官，能释放游离脂肪酸［1］、抵抗素［2-3］、脂联素［4］、肿瘤坏死因子-α 等脂肪细胞因子来影响葡萄糖及脂质代谢，在胰岛素抵抗中有重要角色。

尿石素A 是石榴、草莓、黑莓及胡桃等水果或坚果中鞣花酸经肠道菌群作用产生的活性代谢产物，具有抗炎［5］、抗自由基［6］、胰脏保护作用［7］。Ryu 等［8］证明尿石素A 在促进自噬方面表现出独特的作用，可使秀丽隐杆线虫寿命延长。有研究［9-10］发现尿石素A 能通过提高线粒体功能改善胰岛素抵抗，但机制仍不清楚。因此本研究提出假设，尿石素A 可能通过影响脂肪组织胰岛素信号及自噬改善糖尿病状态下脂肪组织胰岛素抵抗，并进行验证。

1 材料

1.1 仪器 血糖仪及试纸条（上海罗氏制药有限公司）；Multiskan go 型酶标仪（美国热电公司）；HB-P2 型组织包埋机（武汉汉谷医疗科技有限公司）；RM2235 型切片机（德国徕卡公司）；BX43 型显微镜［奥林巴斯（中国） 有限公司］；动物专用电子天平［东西仪（北京） 科技有限公司］。

1.2 试剂与药物 尿石素A （UA） （纯度≥98%，批号ZZS17112001） 购自上海甄准生物有限公司；链脲佐菌素（STZ，批号WXBC1125V） 购于美国Sigma 公司；氯喹（CQ，批号171114） 购自武汉鼎晖生物科技有限公司；小鼠甘油三酯（TG，批号180502A）、空腹胰岛素（FINS，批号180601C）、低密度脂蛋白（LDL-C，批号180502A）、高密度脂蛋白 （HDL-C，批号180502A）、游离脂肪酸（FFA，批号180601A）、脂联素（ADPN，批号180602B）、抵抗素（Resistin，批号180602B） ELISA 试剂盒购自上海优选生物科技有限公司；RIPA 细胞裂解液购自上海碧云天生物技术有限公司；蛋白免疫印迹试剂盒购自北京鼎国生物科技公司；IRS1、p-AKT、Glut4 抗体购自美国CST公司。

1.3 动物与饲料 SPF 级雄性C57BL／ 6 小鼠40 只，体质量（24±2） g，购自新疆医科大学动物实验中心，使用许可证号SYXK （新） 2016-0002。基础饲料由新疆医科大学动物实验中心实验室提供，总热量25 kJ／kg （蛋白质13%、碳水化合物53%、脂肪6%）；高脂饲料（脂肪60%） 购自南通特洛菲饲料有限公司。动物实验得到新疆医科大学实验动物管理与使用委员会的批准。

2 方法

2.1 造模与分组 C57BL／6 小鼠给予普通饲料适应性喂养1 周，随机分为正常组、模型组、尿石素A 组、尿石素A＋氯喹组，每组10 只。除正常组，其余3 组均给予高脂饲料喂养6 周，腹腔注射80 mg／kg STZ 2 次建立糖尿病胰岛素抵抗模型。正常组、模型组灌胃给予生理盐水，尿石素A组灌胃给予尿石素A （50 mg／kg），尿石素A＋氯喹组给予尿石素A （5 mg／kg） 灌胃同时腹腔注射氯喹（5 mg／kg），给药8 周。

2.2 血浆指标检测 给药8 周后，禁食12 h，称定质量、麻醉、眼眶取血，3 000 r／min 离心得到血浆，测定血浆TG、LDL、HDL、空腹游离脂肪酸 （FFA）、空腹胰岛素（FINS）、ADPN、Resistin 水平。计算体脂比，体脂比＝［（肾周脂肪质量＋附睾脂肪质量） ／体质量］×100%，空腹脂肪组织胰岛素抵抗指数（FIRI） ＝空腹FFA×空腹胰岛素。

2.3 脂肪组织病理形态学观察 附睾脂肪取一部分固定于10%多聚甲醛溶液中48 h 后脱水，常规石蜡包埋切片，切片经二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，伊红染色，苏木精复染，梯度脱水，二甲苯透明，树脂封片，电镜下观察。

2.4 Western blot 检测蛋白表达 将各组脂肪组织样品，用RIPA 裂解液裂解后提取总蛋白，BCA 定量后，加入上样缓冲液，100 ℃煮沸10 min。取40 μg 总蛋白，SDSPAGE 电泳后电转于硝酸纤维膜，加入一抗（1∶1 000）4 ℃下孵育过夜，加入二抗（1∶4 000） 孵育1 h。ECL 发光法检测目的蛋白表达。

2.5 统计学分析 用SPSS 22.0 软件进行分析，计量资料以（） 表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 尿石素A 对糖尿病小鼠体质量的影响 与正常组比较，糖尿病组小鼠终体质量降低（P＜0.01）；与模型组比较，尿石素A 组小鼠终体质量略升高，但差异无统计学意义，尿石素A＋氯喹组小鼠终体质量降低（P＜0.01）；与尿石素A 组比较，尿石素A＋氯喹组终体质量降低（P＜0.05）。见表1。

表1 尿石素A 对糖尿病小鼠体质量的影响（g，，n＝10）

表1 尿石素A 对糖尿病小鼠体质量的影响（g，，n＝10）

注：与正常组比较，＃＃P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01；与尿石素A 组比较，ΔP＜0.05。

3.2 尿石素A 对糖尿病小鼠脏器周脂肪质量、体脂比的影响 与正常组比较，模型组的体脂比略有降低，但差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组比较，尿石素A 组、尿石素A＋氯喹组体脂比略有升高，但差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 尿石素A 对糖尿病小鼠脏器周脂肪质量、体脂比的影响（， n＝10）

表2 尿石素A 对糖尿病小鼠脏器周脂肪质量、体脂比的影响（， n＝10）

3.3 尿石素A 对糖尿病小鼠血浆TG、LDL、HDL 水平的影响 与正常组比较，模型组血浆TG、LDL 均升高（P＜0.01），HDL 降低（P＜0.01）；与模型组比较，尿石素A 组LDL 降低，HDL 升高（P＜0.01），TG 降低（P＜0.01），尿石素A＋氯喹组TG、LDL 均降低（P＜0.01），HDL 升高（P＜0.05）；与尿石素A 组比较，尿石素A＋氯喹组TG 降低（P＜0.01）。见表3。

表3 尿石素A 对糖尿病小鼠血脂的影响（， n＝10）

表3 尿石素A 对糖尿病小鼠血脂的影响（， n＝10）

注：与正常组比较，＃＃P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与尿石素A 组比较，△△P＜0.01。

3.4 尿石素A 对糖尿病小鼠血浆FFA、FINS、FIRI 的影响 与正常组比较，模型组小鼠空腹FFA、FINS、FIRI 均增高（P＜0.01）；与模型组比较，尿石素A 组空腹FFA、FIRI 均降低 （P＜0.01），尿石素A ＋氯喹组空腹FFA、FINS、FIRI 均降低（P＜0.05，P＜0.01）。见表4。

表4 尿石素A 对糖尿病小鼠血浆FFA、FINS、FIRI 的影响（， n＝10）

表4 尿石素A 对糖尿病小鼠血浆FFA、FINS、FIRI 的影响（， n＝10）

注：与正常组比较，＃＃P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01。

3.5 尿石素A 对糖尿病小鼠血浆ADPN、Resistin 水平的影响 与正常组比较，模型组小鼠血浆ADPN 水平降低，Resistin水平升高（P＜0.01）；与模型组比较，尿石素A 组小鼠血浆ADPN 水平升高，Resistin 水平降低（P＜0.01），尿石素A＋氯喹组ADPN 水平升高（P＜0.01），Resistin 水平降低（P＜0.01）。见表5。

表5 尿石素A 对糖尿病小鼠血浆ADPN、Resistin 水平的影响（， n＝10）

表5 尿石素A 对糖尿病小鼠血浆ADPN、Resistin 水平的影响（， n＝10）

注：与正常组比较，＃＃P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01。

3.6 尿石素A 对糖尿病小鼠脂肪组织病理形态结构的影响与正常组比较，模型组小鼠可见淋巴结，部分脂肪细胞变大变圆；与模型组比较，尿石素A 组小鼠脂肪细胞不饱满，细胞膜皱缩，尿石素A＋氯喹组小鼠脂肪有小灶坏死，部分区可见少许炎细胞浸润。见图1。

图1 尿石素A 对糖尿病小鼠脂肪组织病理形态结构的影响（HE，×200）

3.7 尿石素A 对糖尿病小鼠脂肪组织胰岛素信号的影响 与正常组比较，模型组小鼠脂肪组织IRS1、p-Akt、Glut4 蛋白表达下调（P＜0.01）；与模型组比较，尿石素A组小鼠脂肪组织IRS1、p-Akt、Glut4 表达上调（P＜0.01），信号通路活性增强；与尿石素A 组比较，尿石素A＋氯喹组脂肪组织IRS1、p-Akt、Glut4 表达下调 （P＜0.05）。见图2。

图2 尿石素A 对糖尿病小鼠脂肪组织胰岛素信号的影响

3.8 尿石素A 对糖尿病小鼠脂肪组织自噬蛋白表达的影响 与正常组比较，模型组小鼠脂肪组织LC3 Ⅱ／I、Beclin1 蛋白表达增强 （P＜0.01），p62 蛋白表达减弱（P＜0.01）；与模型组比较，尿石素A 组小鼠脂肪组织LC3Ⅱ／I、Beclin1 蛋白表达减弱（P＜0.05），p62 蛋白表达增强（P＜0.01）；与尿石素A 组比较，尿石素A＋氯喹组小鼠脂肪组织Beclin1、p62 蛋白表达减弱（P＜0.05）。见图3。

图3 尿石素A 对糖尿病小鼠脂肪组织自噬蛋白表达的影响

4 讨论

胰岛素抵抗是2 型糖尿病的重要特征，脂肪组织胰岛素抵抗表现为胰岛素转导信号异常导致胰岛素促进脂肪合成作用被严重抑制，脂肪分解代谢加强，出现血清游离脂肪酸（FFA） 水平升高等脂肪代谢异常的典型表现，也是肥胖引起胰岛素抵抗的主要因素之一［11］。临床研究发现，血清脂联素水平在肥胖、胰岛素抵抗伴肥胖患者中逐渐降低，提示脂联素是联系肥胖和胰岛素抵抗的纽带［12］；抵抗素作为一种脂肪激素，可引起并参与炎症反应，还可引发脂肪细胞的胰岛素抵抗［13］。因此改善脂肪组织胰岛素信号，调节异常的脂质代谢及脂肪细胞因子紊乱是改善胰岛素抵抗的重要措施。

本实验发现尿石素A 灌胃8 周显著降低c57BL／6 糖尿病小鼠血浆空腹FFA、LDL、Resistin 水平，显著升高HDL、ADPN 水平，脂肪组织胰岛素抵抗指数降低也进一步证实尿石素A 具有显著改善糖尿病小鼠胰岛素抵抗的作用。糖尿病小鼠脂肪细胞体积增大，大脂肪细胞数量增多，与李国生等［14］观察结果一致。尿石素A 干预的小鼠脂肪组织细胞不饱满，细胞膜皱缩，脂肪细胞变小变瘦，以上结果揭示尿石素A 可能通过改善脂肪组织病理，影响其分泌的脂肪因子水平，纠正糖尿病模型小鼠血脂紊乱，从而改善了IR。Toney 等［10］研究显示高脂小鼠腹腔注射尿石素A 能使血浆总胆固醇、LDL 显著降低，TG 降低无统计学意义，ADPN 显著升高，与本实验结果一致。

胰岛素发挥正常生理作用依赖于胰岛素与其细胞膜受体结合及结合后完整的信号传导。胰岛素受体是一个异四聚体，表达于肝脏、脂肪和骨骼肌的细胞膜上［15］。胰岛素受体信号系统包括胰岛素受体（insulin receptor，IR）、胰岛素受体底物（insulin receptor substrate，IRS） 家族、磷脂酰肌醇-3 激酶（phosphatidy linositol-3-kinase，PI3K） 及其下游的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶 （serinethreonine kinase，Akt）、Ras、Raf、MAPK （丝裂原激活蛋白激酶） 等［16］。脂肪组织中的葡萄糖转运体4 （GLUT4） 作为重要的胰岛素信号转导应答器。在T2D 患者脂肪细胞中发现Glut4 减少［17］，转基因小鼠Glut4 基因消融或杂合敲除特别是在脂肪细胞中，导致全身胰岛素抵抗最后进展为糖尿病［18］。尿石素A 干预可使脂肪组织中IRS1／p-Akt／Glut4 信号通路活性显著增强，提高脂肪组织对胰岛素的敏感性，促进其摄取葡萄糖，从而改善胰岛素抵抗状态，而自噬抑制剂氯喹反转了尿石素A 激活胰岛素信号通路的作用。

自噬是自噬体小泡包裹受损的细胞器或错误折叠的蛋白质，并把它们递送给溶酶体分解的过程［19］。LC3Ⅱ／I 是自噬关键蛋白，Beclin 1 是自噬始发过程的指标，p62 作为选择性自噬接头蛋白，其UBA、LIR 结构域的磷酸化使p62靶向结合于泛素化蛋白聚合物并通过自噬作用被溶酶体选择性降解。自噬在正常生理状态下存在平衡，即自噬过程由自噬激活和自噬抑制加以调节平衡，任一方面失衡自噬可能发生异常，过分刺激或不利环境下，自噬可能演变为不良的自噬反应，即过度自噬或自噬障碍，均可扰乱正常自噬，从而严重影响组织细胞功能。低度炎症，氧化应激和内质网应激，胰岛素抵抗和脂肪组织低氧，这些存在于肥胖和糖尿病中的因素可以激活自噬［20］。动物体内和体外对脂肪组织的研究发现，在肥胖和胰岛素抵抗鼠的脂肪组织中自噬的活性升高［21］，Ost 等［22］首次发现肥胖和糖尿病人群来源的脂肪细胞中自噬成分LC3 增加。吴彦菊等［23］在T2D 的小鼠模型中发现，与正常组相比，糖尿病组小鼠胰岛β 细胞BeclinlmRNA 表达显著增加。本实验显示，与正常组比较，糖尿病小鼠脂肪组织自噬紊乱，Beclin1、LC3Ⅱ表达显著增强，p62 蛋白表达显著减弱，显示自噬过度激活，而且伴随胰岛素信号通路被抑制；尿石素A 可纠正这种自噬蛋白异常表达向正常方向恢复，而且胰岛素信号通路激活，胰岛素抵抗状态改善。Rocha 等［24］研究发现，8周耐力运动干预后不但可以显著降低肥胖大鼠体质量、内脏脂肪系数，还能使附睾脂肪细胞自噬蛋白标志物LC3Ⅱ和Beclin1 蛋白表达显著下降，提示长期耐力训练能降低肥胖大鼠的脂肪细胞异常自噬活性，这与UA 的作用相似，提示了尿石素A 对自噬的有益调节作用。氯喹是一种自噬抑制剂，抑制自噬体与溶酶体融合阶段，严重阻碍自噬流，联用氯喹后脂肪组织胰岛素IRS1／p-Akt／Glut4 信号通路显著被抑制，说明自噬过度激活或自噬过程障碍均可导致脂肪组织胰岛素抵抗。

氯喹在临床上用于控制疟疾症状，还可用于治疗肠道外阿米巴病及肝脓疡、类风湿性关节炎、红斑性狼疮及肾病综合征等。本实验发现，与单独尿石素A 干预比较，联合氯喹后糖尿病小鼠体质量减轻，血浆甘油三酯水平降低，说明氯喹和尿石素A 具有协同降低血浆TG 的作用，但前期研究发现尿石素A 明显改善肝脂肪变，加用氯喹使肝脏TG 增加，肝脏脂肪变加重，提示尽管氯喹降低血浆TG，但可能增加了TG 的肝异位沉积。

综上所述，尿石素A 可以作用于脂肪组织，改变脂肪组织分泌的脂肪细胞因子水平，调节糖尿病小鼠血脂代谢，通过纠正过度自噬，激活脂肪组织IRS1／p-AKT／Glut4 胰岛素信号通路，从而减轻糖尿病小鼠胰岛素抵抗。