我国首株兔出血症病毒2型的致病性及病理学初步研究

范志宇 陈萌萌 胡波

摘要：为深入研究国内首次发现并鉴定的兔出血症病毒2型（RHDV2）四川分离株SC2020/04的致病性，用SC2020/04 RHDV2分离株，以皮下注射方式感染25日龄仔兔和4月龄成年兔，记录家兔发病情况，对病死兔进行剖检，并取肝脏样品进行血凝（HA）和核酸检测，取心、肝、脾、肺、肾、十二指肠等组织制作病理切片，进行病理学研究。试验结果显示，感染后仔兔18 h出现死亡，成年兔40 h出现死亡，死亡率均为5/5;感染后试验兔出现典型兔瘟临床症状，濒死时四肢抽搐、角弓反张，部分死亡兔可见口鼻流出红色血液;剖检主要病变为肝脏肿大并伴有明显的小叶样改变，脾肿大，肺、肝、脾和肾出现充血和弥漫性瘀点出血，腹腔内有血样渗出物;血凝试验结果显示，病死仔兔和成年兔肝脏血凝效价没有明显差异;采用鉴别经典RHDV/RHDV2的RT-PCR方法检测攻毒死亡兔肝脏样品，结果显示为RHDV2阳性;病理学观察可见多脏器严重出血、肿胀，淋巴细胞和中性粒细胞大量浸润，病死仔兔十二指肠组织严重糜烂，成年兔十二指肠病变较轻。本研究对我国首个RHDV2毒株进行了致病性初探和病理学观察，研究结果可以为RHDV2疫苗研发和致病机理研究奠定基础。

关键词：兔出血症病毒2型;临床症状;剖检病变;病理学观察

中图分类号： S855.3  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2020）11-0143-05

收稿日期：2020-05-20

基金项目：国家重点研发计划（编号：2018YFD0502203）;现代农业产业技术体系建设专项资金（编号：CARS-43-C-1）。

作者简介：范志宇（1982—），男，山西太谷人，博士，副研究员，主要从事家兔疫病防控技术研究，E-mail：fanzhiyu2007@163.com;共同第一作者：陈萌萌（1987—），女，江苏连云港人，博士，助理研究员，主要从事家兔疾病防治与兽医生物技术研究，E-mail：moonchen2010@yeah.net。

通信作者：王 芳，博士，研究员，主要从事家兔重要疫病致病机制及防控技术研究。E-mail：rwangfang@126.com。  兔出血症（rabbit hemorrhagic disease，简称“RHD”）俗称“兔瘟”，是由兔出血症病毒（rabbit hemorrhagic disease virus，简称“RHDV”）引起的一种急性、烈性、高致死性传染病。经典RHDV只感染家兔，2月龄以上家兔易感，病死率可达90%，常于感染后48～72 h死亡，死亡兔以呼吸系统和肝、脾、肾、心等实质脏器瘀血、肿大和出血为特征，幼兔不易感[1]。2010年，在法国首次发现了RHDV的新毒株，命名为RHDV2或RHDVb，随后该毒株蔓延到意大利、西班牙、葡萄牙、英格兰、苏格兰和德国，在欧洲RHDV2取代经典RHDV的趋势正在扩大[2-3]。在澳大利亚和亚速尔群岛也有检测到RHDV2的相关报道[4-5]。2020年4月，我国四川省发生疑似病例，经多种检测方法确定病原为RHDV2[6]，这是我国首次发现RHDV2型毒株[7]，由此可见，RHDV2的流行趋势正在世界范围内逐步扩大。据OIE数据报道，当感染RHDV2时，7～15日龄的幼龄动物中也可以观察到明显的临床症状和死亡，病死率可达90%。为了掌握我国首次发现的RHDV2型毒株的致病性和攻毒动物发病特征，本研究以25日龄仔兔和4月龄成年兔为攻毒对象，观察攻毒后试验兔的临床症状、剖检病变以及病理学变化，以期为RHDV2疫苗研发和致病机理研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要试验材料

含兔出血症病毒2型病死兔肝脏由江苏省农业科学院兽医所兔病学科团队鉴定并保存[6]，命名为SC2020/04（GenBank登錄号：MT383749）;经典兔出血症病毒对照RHDV皖阜株由笔者所在实验室保存;阴性肝脏来自邳州市东方养殖有限公司的SPF兔。实验兔购自江苏省明天农牧科技有限公司，合格证号NO.202004338。

1.2 分离株感染试验

1.2.1 感染用病毒制备 在生物安全柜中，剔除含RHDV2病死兔肝脏上结缔组织，取少许肝脏，加入PBS后匀浆，使匀浆中含肝脏质量（g） ∶ PBS的体积（mL）为1 ∶ 10，反复冻融3次，以8 000 r/min离心30 min，取上清用0.22 μm滤器进行除菌，标记为SC2020F1备用。

1.2.2 实验兔饲养管理 实验兔饲养于负压强毒攻毒动物房，试验过程中注意人员的防护，产生的垃圾和动物尸体等经高压灭菌后无害化处理，试验结束后对环境进行彻底消毒。动物处理详见《病害动物和病害动物产品生物安全处理规程》（GB 16548—2006）。

1.2.3 感染试验观察及取样 将5只25日龄仔兔和5只4月龄成年兔分别颈部皮下注射SC2020F1，1 mL/只，使用监控设备观察发病死亡情况，及时剖检死亡兔并无菌取相关组织器官备用。

1.3 微量血凝试验

取病死兔少许肝脏样品，剪碎，按1 g ∶ 10 mL加入PBS后匀浆，反复冻融3次，以8 000 r/min离心 30 min，取上清进行微量血凝试验，具体参照《兔病毒性出血病血凝和血凝抑制试验方法》（NY/T 572—2016）。

1.4 死亡兔核酸鉴定

将死亡兔肝脏样品与DEPC水按1 g ∶ 10 mL比例研磨成悬液，离心取上清，按照Trizol法提取RNA，利用反转录试剂盒获得病毒cDNA，用笔者所在实验室建立的鉴别经典RHDV/RHDV2的RT-PCR方法，以cDNA为模板，进行兔出血症病毒VP60基因片段的扩增。经典RHDV扩增产物大小为193 bp，RHDV2扩增产物大小为829 bp。

1.5 病理学观察

将无菌采集的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、十二指肠等组织器官浸入4%多聚甲醛溶液中固定，经石蜡包埋、切片，进行H.E染色，在光学显微镜下观察病理学变化并拍照;以无菌采集安乐死后健康25日龄仔兔和4月龄成年兔正常组织制作病理切片作为对照。

2 结果与分析

2.1 临床症状

通过监控观察发现，攻毒兔在注射病毒后12 h内有少量的采食和饮水行为，之后攻毒仔兔食欲、饮欲基本废绝，成年兔采食和饮水次数比仔兔稍多，但采食量明显下降，直至死亡。攻毒兔死亡前几小时精神沉郁、呼吸困难、反应迟钝，最紧急的病例在症状出现后1～2 h内迅速死亡，濒死前表现有短暂的兴奋，突然倒地，划动四肢呈游泳状，濒死时四肢抽搐，用力蹬后肢，角弓反张，部分死亡兔可见口鼻流出红色血液（图1），肛门松驰，肛周有少量淡黄色黏液和粪便附着。

2.2 剖检病变

剖检可见各脏器有不同程度的肿胀、充血、出血，尤其是胸腺、肺脏、肝脏出现严重出血。鼻腔、喉头和气管黏膜、气管环瘀血、出血，气管和支气管内有泡沫状血液;胸腺出血，散在针头大出血点;肺有不同程度充血、瘀血、水肿，切开肺脏流出多量红色泡沫状液体;肝脏瘀血、肿大、质脆，表面发黄，切面粗糙，切开流出大量暗红色血液;脾脏瘀血、肿大，呈暗红色;肾脏肿大，并见有大小不等的出血点，呈黑紫色;膀胱积尿，内充满黄褐色尿液，部分病例尿液中混有絮状凝块。血液凝固不良，攻毒兔死亡后肺脏、肝脏等依然出血，胸腔和腹腔可见有未凝固的血液，死亡时间较长的在胸腔和腹腔有血凝块（图2）。

2.3 微量血凝试验

颈部皮下注射SC2020F1毒株的10只家兔全部在72 h内死亡。用微量血凝试验测定不同时间死亡的攻毒兔肝脏样本血凝效价。结果显示仔兔死亡时间明显早于成年兔，死亡更快，病死仔兔和成年兔肝脏血凝效价没有明显差异（表1）。

2.4 核酸鉴定

以病毒cDNA为模板，使用经典RHDV/RHDV2鉴别引物进行扩增，结果显示，10个攻毒死亡兔肝脏样品在829 bp位置均出现单一的RHDV2的特异

性条带，在193 bp位置未出现经典RHDV特异性条带（图3）。说明本试验攻毒死亡兔全部由于感染RHDV2死亡，且没有污染经典RHDV。

2.5 病理变化

对死亡仔兔和成年兔各脏器做石蜡切片，染色观察结果见图4和图5。

攻毒死亡仔兔肝脏组织肝小叶结构不甚清晰，肝细胞索排列紊乱，肝细胞胞核染色质边集，较多肝细胞胞质中可见大小不一的脂肪空泡（图4-E 绿色箭头）; 较多肝细胞点状坏死，胞核碎裂、消失;个别汇管区周围可见结缔组织增生（图4-E 蓝色箭头）。脾脏组织白髓数量明显减少，残留的白髓体积大小不一（图4-D 黑色箭头）;红髓正常结构消失，大量纤维组织增生（图4-D 绿色箭头），缺少红细胞和淋巴细胞。肺脏组织局部支气管黏膜可见水肿和毛细血管充血，伴散在的炎性细胞浸润;可见

少数几处肺泡腔出血（图4-C黑色箭头）。肾小球毛细血管瘀血，少量毛细血管袢玻璃样变（图4-B绿色箭头）;少量肾小管坏死（图4-B红色箭头）;多数肾小管可见刷状缘脱落（图4-B黄色箭头）。十二指肠组织严重糜烂，黏膜上皮细胞坏死、脱落（图4-A 绿色箭头），固有层裸露，毛细血管充血扩张（图4-A黑色箭头）;较多腺体结构消失（图4-A蓝色箭头）;固有层底部可见少量炎性细胞浸润（图4-A 黄色箭头），心脏未见明显病变。仔兔与成年兔主要组织病理学差异是仅在仔兔中发现肠道病变。

攻毒死亡成年兔肝脏组织肝小叶结构不甚清晰，较多肝细胞点状坏死（图5-E黑色箭头），胞核碎裂、消失;少量肝窦可见瘀血、出血;汇管区局部可见结缔组织增生，伴散在的炎性细胞浸润（图5-E绿色箭頭）。脾脏组织白髓数量明显减少，残留的白髓体积减小（图5-D黑色箭头）;红髓正常结构消失，可见大量嗜酸性纤维样物质。肺细支气管中可见巨噬细胞浸润（图5-C 蓝色箭头）;广泛肺泡腔轻度增厚（图5-C黑色箭头）;小血管周围可见少量炎性细胞浸润（图5-C绿色箭头），有的可见血栓形成（图5-C黄色箭头）。肾小球毛细血管瘀血，少量毛细血管袢玻璃样变（图5-B绿色箭头）;少量肾小管坏死（图5-B红色箭头）;多数肾小管可见刷状缘脱落，少量肾小管中可见嗜酸性细颗粒状物质。十二指肠（图5-A）和心脏（图5-F）未发现明显病变。

3 讨论

在本研究中，中国分离株SC2020/04（RHDV2/GI.2）引起的临床症状和剖检病变与GI.1毒株引起的经典RHD非常相似，主要区别是40日龄以下家兔对经典RHDV不易感，哺乳仔兔不发病[8]，而RHDV2可引起仔兔发病死亡，OIE出版的《陆生动物疫苗和诊断手册》指出7～15日龄的幼龄动物中可以观察到明显的临床症状和死亡率，Dalton KP等[9]研究发现，RHDV2对11日龄及以上家兔即可感染致死，死亡兔伴有黄疸症状，但是SC2020/04毒株攻毒死亡兔并未发现有黄疸症状，可能与毒株致病力相关。与GI.1毒株相比，Dalton KP等[9]和le Gall-Recule等[10]研究指出GI.2可引起幼兔死亡，死亡率可达50%，OIE官方数据病死率可达90%。本研究结果显示，仔兔和成年兔均在72 h以内全部死亡，仔兔平均死亡时间为25.6 h，成年兔平均死亡时间为54.8 h，死亡率均为5/5，说明SC2020/04毒株比欧洲较早报道的GI.2菌株致病性更强。因此，可以推测，SC2020/04毒株一旦在中国流行，将对养兔业产生严重危害甚至造成毁灭性打击，相关疫苗研究刻不容缓。

RHDV作为一种嗜肝病毒，对肝脏组织具有明显的致病作用。与以往所有关于RHD的研究一致，肝脏是SC2020/04的靶器官，表现出严重的病理损伤，组织肝小叶结构不甚清晰，较多肝细胞点状坏

死，胞核碎裂、消失。总之，在仔兔和成年兔引起了与GI.1病毒相同的肝损伤。在成年兔和仔兔脾脏组织白髓数量明显减少，残留的白髓体积大小不一，这可能与病毒感染造成的淋巴细胞减少有关。Marques等发现感染兔肝脏和脾脏的淋巴细胞明显减少[11]，Teixeira等也发现成年兔急性RHDV致死性感染中调节性T细胞也减少[12]。另外，仔兔和成年兔组织病理病变的主要差异是仔兔的十二指肠有明显的病理损伤，而成年家兔不明显，这可能与病毒受体表达、仔兔先天性免疫和肠道功能的改变有关[13-15]。

参考文献：

[1]Abrantes J，van der Loo W，le Pendu J，et al. Rabbit haemorrhagic disease （RHD） and rabbit haemorrhagic disease virus （RHDV）：a review[J]. Veterinary Research，2012，43（1）：12.

[2]le Gall-Recule G，Zwingelstein F，Boucher S，et al. Detection of a new variant of rabbit haemorrhagic disease virus in France[J]. Vet Rec，2011，168（5）：137-138.

[3]王 芳，陈萌萌，宋艳华，等. 兔出血症病毒新毒株RHDV2 的流行与控制（综述） [J].江苏农业科学，2016，44（ 9）：1-3.

[4]Strive T，Piper M，Huang N，et al. Retrospective serological analysis reveals presence of the emerging lagovirus RHDV2 in Australia in wild rabbits at least five months prior to its first detection[J]. Transbound Emerg Dis，2020，67（2）：822-833.

[5]Rouco C，Abrantes J，Serronha A，et al. Epidemiology of RHDV2 （Lagovirus europaeus/GI.2） in free-living wild European rabbits in Portugal[J]. Transbound Emerg Dis，2018，65（2）：e373-e382.

[6]魏后军，胡波，范志宇，等. 兔出血症病毒2 型的分离鉴定与序列分析[J]. 江苏农业学报，2020，36（ 2）：404-409.

[7]Hu B，Wei H J，Fan Z Y，et al. Emergence of rabbit hemorrhagic disease virus 2 in China in 2020[J]. Authorea，May 06，2020. DOI：10.22541/au.158880187.76685134.

[8]王 芳，范志宇，薛家宾. 兔病图鉴[M]. 北京：中国农业科学技术出版社，2019：68-84.

[9]Dalton K P，Nicieza I，Abrantes J，et al. Spread of new variant RHDV in domestic rabbits on the Iberian Peninsula[J]. Vet Microbiol，2014，169（1-2）：67-73.

[10]le Gall-Recule G，Lavazza A，Marchandeau S，et al. Emergence of a new lagovirus related to rabbit haemorrhagic disease virus[J]. Vet Res，2013，44：81.

[11]Marques R M，Teixeira L，Aguas A P，et al. Immunosuppression abrogates resistance of young rabbits to rabbit haemorrhagic disease （RHD）[J]. Vet Res，2014，45：14.

[12]Teixeira L，Marques R M，Aguas A P，et al.Regulatory T cells are decreased in acute RHDV lethal infection of adult rabbits[J]. Vet Immunol Immunopathol，2012，148（3/4）：343-347.

[13]Ruvoen-Clouet N，Ganiere J P，Andre-Fontaine G，et al. Binding of rabbit hemorrhagic disease virus to antigens of the ABH histo-blood group family[J]. J Virol，2000，74（24）：11950-11954.

[14]Kopecky J，Grubhoffer L，Kovar V，et al. A putative host cell receptor for tick-borne encephalitis virus identified by anti-idiotypic antibodies and virus affinoblotting[J]. Intervirology，1999，42（1）：9-16.

[15]Neimanis A，Pettersson U L，Huang N N，et al.Elucidation of the pathology and tissue distribution of Lagovirus europaeus GI.2/RHDV2 （rabbit haemorrhagic disease virus 2） in young and adult rabbits （Oryctolagus cuniculus） [J]. Vet Res，2018，49：46. 陳赛赛，郑亚婷，郭容利，等. 几株伪狂犬病病毒的增殖特性与保存条件[J]. 江苏农业科学，2020，48（11）：148-152.