石油烃污染对浒苔生长和抗氧化指标的影响

董越 陈榕榕 谢汶龙

摘要：为探讨石油烃污染对浒苔生长和抗氧化指标的影响，选择原油和润滑油饱和溶液为母液，按饱和溶液 1 ∶ 5、1 ∶ 8、1 ∶ 10的比例连续培养浒苔7 d，于6 h、24 h、48 h、96 h、7 d分别取样测定浒苔的抗氧化指标和油的浓度。结果表明，原油和润滑油处理蛋白质含量呈先升高后降低的趋势，叶绿素含量降低，原油处理的浒苔叶绿素含量比润滑油处理叶绿素含量低。原油处理显著抑制了浒苔过氧化氢酶活性，过氧化物酶活性呈不规律的变化，前期（6～48 h）上升后期下降，但在7 d时过氧化物酶活性与同期无油对照相比显著增加（P<0.05）;还原力前期显著增加后期下降，在6、24、48 h时，还原力都有显著变化（P<0.05）;浒苔对原油有一定的吸收，1 ∶ 10处理下油的浓度有显著性降低（P<0.05），其余处理变化不显著。润滑油处理对浒苔前期CAT活性也有一定的抑制作用，但变化力度没有原油的大，后期反而增加;POD活性呈先上升后下调的趋势;润滑油处理浒苔还原力的变化没有原油处理明显，也是呈先上升后下调的趋势;浒苔对润滑油有一定的吸收，并且1 ∶ 8和1 ∶ 10处理下油的浓度显著性降低。原油和润滑油处理对浒苔都有一定的伤害性，浒苔对原油更为敏感，原油对浒苔的伤害性更强;浒苔可以通过调节自身酶的活性来适应石油烃污染。

关键词：浒苔;石油烃;污染;抗氧化

中图分类号： X74  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2020）11-0288-05

收稿日期：2019-05-11

基金项目：浙江海洋大学大学生创新项目（编号：xj2018011）;浙江海洋大学博士启动基金（编号：Q1701）。

作者简介：董 越（1997—），女，山东烟台人，研究方向为海洋生物学。E-mail：1770685036@qq.com。

通信作者：范美华，博士，副教授，研究方向为藻类的抗逆性机理。E-mail：dinger503@163.com。  石油产业是高风险产业，受地震、海啸、风暴潮和雷电等不可控自然因素的影响，同时浙江舟山附近海域是我国海上运输最繁忙的航道，石油运输过程中潜在的溢油突发事件风险高，比如2018年1月我国东海“桑吉”号事故溢油事件。生物修复技术以其经济、环保、处理效果好、无二次污染、可对石油污染区域进行原位修复、与物理化学方法相比降低石油的污染损害等优势被视为最经济有效和最具使用前景的石油污染治理措施[1-3]。海洋藻类因其在石油污染中具有净化和供氧双重功能，成为溢油生物治理的重要方向。已有的研究表明，低浓度石油烃污染物在某种程度上可以促进海洋微藻的快速繁殖，甚至诱发赤潮藻的过度繁殖而引起赤潮的发生。例如，小球藻石油被吸收后可以转化为自身的油脂含量[4]。另外，三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）和青島大扁藻（Platymonas helgolandica var. tsingtaoensis）对石油烃污染具有一定的抗逆性，并且小球藻还可以利用石油转变为自身的物质[5-6]。虽然对石油烃污染降解的研究在微藻中研究较多，但是大型海藻对石油烃降解的研究较少，特别是石油烃污染对浒苔（Ulva prolifera）的生长和抗氧化指标的影响变化未见研究报道。

浒苔（Ulva prolifera）属于绿藻纲（Chlorophyta）石莼目（Ulvales）石莼科（Ulvaceae）石莼属（Ulva），是绿潮的优势种，在海洋群落结构和维持海洋生态平衡中起到关键的作用，在舟山海域和青岛海域频繁暴发，并且营养丰富，具有很好的应用前景。石油烃的污染具有很大的潜在危险，对浒苔的生长和基因的表达以及自身对石油烃降解吸附能力都有很大的影响。本试验以浒苔为研究对象，研究原油和润滑油处理对浒苔生长发育和抗氧化指标的影响，以及对不同油品降解吸收的能力，为石油烃污染的防治提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

浒苔于2018年6月采自青岛海域，采集后洗净，先刷掉附着生物和杂藻，再用0.2% KI消毒，处理后用无菌海水冲洗。取处理后新鲜浒苔放在培养基中培养，在光照度60 μmol/（m2·s）、光照周期12 h光照/12 h黑暗的光照培养箱中暂养2周以上。

1.2 试验方法

1.2.1 原油水溶性母液的制备 试验用油为原油和润滑油。由于油难溶于水，将试验用油与无菌海水（0.2 μm滤膜过滤，灭菌）按1 ∶ 9（体积比）混合，置于磁力搅拌机上，连续搅拌24 h后，静置4 h，分离出下层水相即为油母液。将母液置于冰箱4 ℃保存。

1.2.2 试验浓度设定及样品处理 采用紫外分光光度法[7-8]测定母液浓度。分别配制5、10、 20、 30、40、50 mg/L的系列标准样品，以正己烷（透光率不小于90%）为空白对照，在250 nm波长下测定标准系列，绘制标准曲线y=0.012 2x+0.000 4，r2=0.999。

1.2.3 试验设定 根据标准曲线计算得出原油母液的浓度为6.24 mg/L，润滑油母液的浓度为 7.12 mg/L。根据母液测定结果以及GB 3097—1997《海水水质标准》中Ⅰ类和Ⅱ类海水中石油类的含量≤0.05 mg/L，Ⅲ类海水中石油类含 量≤0.3 mg/L，Ⅳ类海水石油含量≤0.5 mg/L，用无菌海水（2 μm滤膜过滤，灭菌）按1 ∶ 5、1 ∶ 8、1 ∶ 10 进行稀释，每个浓度设定3个平行组。将浒苔放到不同浓度里，置于25 ℃光照培养箱培养，分别于培养0、6、24、48、96、7 d进行取样测定。

1.2.4 指标测定 蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝法[9];叶绿素含量的测定采用分光光度法[10];过氧化物酶（POD）活性的测定采用愈创木酚法;过氧化氢酶（CAT）活性的测定采用紫外分光光度法[11];还原力的测定采用铁氰化钾法;油浓度的测定采用紫外分光光度法[12]。.

1.3 数据处理

利用SPSS 20.0和Excel 2016软件对所有数据进行方差分析和差异性分析。

2 结果与分析

2.1 原油和润滑油培养对浒苔蛋白质含量的影响

蛋白质的标准曲线为y=0.006 4x-0.015 2（r2=0.994 8）。可溶性蛋白作为植物抗逆性指标，主动参与胁迫时植物的渗透调节，是除脯氨酸、可溶性糖外植物中重要的有机渗透调节物质。如图1所示，无油处理下，以6 h无油处理的浒苔蛋白质含量为对照，浒苔的蛋白质含量呈先上升后下降的趋势，在48、96 h时蛋白质含量呈显著性升高，7 d时蛋白质含量显著降低（P<0.05）。原油培养在6 h时，以6 h无油处理的浒苔蛋白质含量为对照，浒苔蛋白质的含量稍微有点上升，但差异不显著。原油1 ∶ 8和1 ∶ 10处理的浒苔蛋白质含量呈现为先上升后下降再上升再下降的趋势，分别在24、48 h时达到最高点，与6 h无油处理对照差异显著（P<0.05）。润滑油饱和油处理的浒苔在6 h时蛋白质含量与无油处理6 h相比显著提高（P<0.05），其他处理间差异不显著。在96 h时，1 ∶ 5和1 ∶ 8润滑油处理的浒苔蛋白质含量达到最高点，与96 h无油处理差异显著（P<0.05），随着时间的延长在7 d时，浒苔蛋白质含量都呈下降趋势。

2.2 原油和润滑油培养对浒苔叶绿素含量的影响

叶绿素是进行光合作用的主要色素。如图2所示，原油培养的浒苔在6 h时，叶绿素含量与无油对照无显著性差异，随后随着时间的延长呈现叶绿素显著下调的趋势。润滑油饱和油、1 ∶ 5和1 ∶ 10处理6 h时与同期无油处理对照相比显著下调（P<0.05），在48 h时，1 ∶ 10处理的浒苔叶绿素含量还有显著性升高。说明原油对浒苔的伤害性较强，影响了浒苔叶绿素的光合作用，使叶绿素的含量显著降低。

2.3 原油和润滑油培养对浒苔CAT活性的影响

过氧化氢酶是清除氧自由基的关键酶，催化过氧化氢为氧气和水。如图3所示，无油的对照处理，浒苔CAT活性呈先上升后下调的趋势，96 h达最大值。原油处理的浒苔CAT活性在前期降低，与无油对照相比差异性显著。原油饱和油、1 ∶ 5、1 ∶ 8和 1 ∶ 10 处理的浒苔分别在96 h、6 h、7 d、24 h达到最低值，分别为同期无油对照的 17.88%、42.49%、17.80%、12.66%，并且与对照相比差异显著（P<0.05）。润滑油1 ∶ 8处理的浒苔样品CAT活性在6～24 h 内与同期的无油对照相比呈显著上升趋势。

2.4 原油和润滑油培养对浒苔POD活性的影响

过氧化物酶是由微生物或植物所产生的一类氧化还原酶，它们能催化很多反应。过氧化物酶是以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶。如图4所示，无油的对照处理，浒苔的POD活性呈现先6～96 h上升，第7天下调的趋势，在96 h达到最大值，与6 h的无油处理相比差异显著（P<0.05）。原油培养时，POD活性呈现差异性变化，但是规律性不强。润滑油处理在6 h时与无油对照相比，POD活性显著升高（P<0.05）;在48 h时饱和油和1 ∶ 10处理浒苔的POD活性与同期无油对照相比显著升高（P<0.05），1 ∶ 5处理显著降低（P<0.05）。7 d润滑油处理的POD活性相比48 h时整体呈下调趋势，但1 ∶ 5、1 ∶ 8和1 ∶ 10处理的POD活性与第7天无油对照相比仍有显著增加（P<0.05）。因此，過氧化物酶的活性呈现先上升后下调的趋势，但是与无油对照相比，下降的幅度较低。

2.5 原油和润滑油培养对浒苔还原力的影响

藻类在压力的胁迫下容易产生氧自由基，抗氧化剂是通过自身的还原作用给出电子而清除自由基的，还原能力越强，抗氧化能力越强。由图5所示，无油的对照处理还原力在7 d内无差异性变化。原油培养在6、24、48 h时，还原力有显著性变化（P<0.05）;在6 h时，饱和油、1 ∶ 5、1 ∶ 8和 1 ∶ 10 处理的还原力分别为无油对照的1.56、1.64、1.61、1.56倍（P<0.05），但是原油各个处理之间无显著性差异。原油处理时，还原力呈先上升后下调的趋势，饱和油和1 ∶ 5的处理在48 h时还原力急剧下降，1 ∶ 8和1 ∶ 10处理时，还原力在48 h达最大值，随后下调。润滑油处理时，浒苔还原力的变化没有

原油的明显，也是呈先上升后下调的趋势，饱和油润滑油处理96 h达最大值，为无油对照的1.10倍。

研究结果表明，原油比润滑油对浒苔培养的影响较大，导致浒苔自身的抗氧化机制的应激反应，抗氧化能力增强，所以还原力在前期有很大的升高，适应后后期抗氧化能力降低。

2.6 浒苔对原油和润滑油吸收的影响

如图6所示，原油的饱和油浓度和润滑油饱和油浓度分别为6.24、7.12 mg/L，经过7 d后，原油和润滑油的浓度都有降低。润滑油饱和油、1 ∶ 5、1 ∶ 8 和1 ∶ 10处理7 d后分别吸收原浓度的 0.98%、1620%、8.38%、18.99%;原油饱和油、1 ∶ 5、1 ∶ 8和1 ∶ 10处理7 d后原油浓度分别降低响应浓度的1.92%、4.00%、6.41%、16.67%。说明浒苔对润滑油的吸收能力要比对原油的吸收能力强。

3 讨论与结论

在石油烃污染的胁迫下，需氧细胞在代谢过程中产生一系列活性氧簇（reactive oxygen species，ROS），包括O-2·、H2O2 、HO2·、·OH等。ROS的积累，会造成细胞的膜质过氧化，对细胞造成一定的伤害。为了清除ROS的毒害，藻类主要是通过抗氧化酶活性或者抗氧化酶基因的表达，来提高抗性[13-14]。抗氧化系统主要包括SOD、CAT、POD、GR和APX等抗氧化酶，在藻类的抗逆性机制中起到重要的作用。目前为止，国内外有诸多关于石油污染物对海洋生物抗氧化系统影响的研究[15]。张聿柏通过石油烃对3种微藻的毒害和响应机理研究表明，石油烃胁迫下，3种微藻的叶绿素含量和叶绿素荧光指数都有显著的降低，抗氧化酶系统中SOD、GR活性均出现波动，呈先升高后下调的趋势[6]。本研究表明，原油和润滑油处理蛋白质含量呈先升高后降低的趋势，叶绿素含量降低，原油处理的浒苔叶绿素含量比润滑油处理低。原油处理显著抑制了浒苔过氧化氢酶活性，过氧化物酶活性呈不规律的变化，前期（6～48 h）上升后期下降，但在7 d时过氧化物酶活性与同期无油对照相比显著增加（P<0.05）;还原力前期显著增加后期下降，在6、24、48 h时，还原力都有显著性变化（P<0.05）;浒苔对原油有一定的吸收，1 ∶ 10处理下油的浓度有显著性降低（P<0.05），其余处理变化不显著。润滑油处理对浒苔前期CAT活性也有一定的抑制作用，但变化力度没有原油的大，后期反而增加;POD活性呈先上升后下调的趋势;润滑油处理浒苔还原力的变化没有原油处理变化的明显，也是呈先上升后下调的趋势;浒苔对润滑油有一定的吸收，并且 1 ∶ 8 和1 ∶ 10处理下油的浓度显著性降低。结果表明，浒苔对润滑油的适应能力更强，原油对浒苔的影响更大。浒苔可以通过调节自身的酶的活性来适应石油烃污染，蛋白质和叶绿素含量降低，光合作用受到破坏，浒苔抗氧化系统中的POD活性被激活和还原力也增加，但在长期的胁迫条件下POD活性和还原力降低，而CAT可能在润滑油的后期起作用。

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