连续流动分析-盐酸萘乙二胺分光光度法测定酱油中的亚硝酸盐和硝酸盐

杨 健，印 杰，钟 霖，李 斌，邢朝宏*

（1.上海市质量监督检验技术研究院，上海 200233；2.国家食品质量监督检验中心（上海），上海 200233）

亚硝酸盐和硝酸盐广泛存在于人类生活环境中，是自然界中较普遍的两类含氮化合物，也是工业生产中比较常用的食品添加剂。但是，摄入高剂量的亚硝酸盐会对人体产生很大的毒性，而硝酸盐进入人体经过口腔和肠道微生物作用后，会转化为具有一定毒性的亚硝酸盐，亚硝酸盐在人体中还极易转化为具有强致癌作用的亚硝胺，进而对人体健康构成潜在的威胁[1-2]。因此，国家对食品中的亚硝酸盐和硝酸盐含量有严格的限定，GB 2760—2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》中规定亚硝酸盐的最大使用量为0.15 g/kg，硝酸盐的最大使用量为0.5 g/kg，同时对其残留量也作出明确规定，如酱卤肉制品类的亚硝酸盐（以亚硝酸钠计）、硝酸盐（以亚硝酸钠计）最大残留量均为30 mg/kg，而GB 2762—2017《食品安全国家标准食品中污染物限量》中规定腌渍蔬菜的亚硝酸盐（以亚硝酸钠计）的限量值为20 mg/kg。

酱油是中国传统的调味料，主要以黄豆或豆粕、小麦或面粉为原料经过制曲、发酵、压榨等工序酿制而成[3-5]。陈艳等[6]研究发现，几种潮汕酱料中的亚硝酸盐（以亚硝酸钠计）含量为0.5～2.8 mg/kg，硝酸盐以（以硝酸根计）含量为94～214 mg/kg，而王楠等[7]研究发现，市场上销售的老抽类酱油均含有一定量的亚硝酸盐，并且与添加焦糖有直接的关系。目前，酱油相关标准中仅商业行业标准SB/T 10431—2007《榨菜酱油》中规定亚硝酸盐（以亚硝酸钠计）的限量值为10 mg/L，而未对硝酸盐的限量值作出明确规定。因此，通过对酱油中亚硝酸盐和硝酸盐的含量进行研究，可以调整酱油的日常推荐使用量以减少来源于酱油中亚硝酸盐和硝酸盐的摄入量，从而防止亚硝酸盐和硝酸盐的过量摄入带来的危害。

亚硝酸盐与硝酸盐含量的测定在国标GB 5009.33—2016《食品安全国家标准食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》中规定的第一法为离子色谱法、第二法为分光光度法、第三法为紫外分光光度法（蔬菜、水果中硝酸盐的测定）。由于酱油颜色较深，通常呈红褐色，且老抽酱油的颜色比生抽酱油更深，在波长538 nm处进行分光比色时干扰较大，因而分光光度法无法有效测定亚硝酸盐和硝酸盐的含量，而采用活性炭脱色[8-10]后测定硝酸盐的干扰因素较多，需采取步骤消除共轭离子及亚硝酸盐的干扰；电化学方法[11-12]制备电极的试验步骤繁杂，且成本较高；高效毛细管电泳法[13]则由于氯离子容易对亚硝酸根离子的测定产生干扰；离子色谱法[14-16]由于酱油中较高盐分对Ag柱和Na柱的损耗较大[17]。

本研究采用连续流动分析（continuous flow analysis，CFA）-盐酸萘乙二胺分光光度法[18-21]同时测定酱油中的亚硝酸盐和硝酸盐，即试样经沉淀蛋白质后，自动进样且采用气泡隔断样品以降低样品的扩散和重叠，样品和载液试剂在化学分析模块中经过惰性玻璃圈上下旋转而得以混合，进一步通过透析膜在线透析而被过滤和稀释，能有效消除酱油的颜色和排除颗粒杂物干扰后，采用双通道同时测量，即一条通道中亚硝酸盐与磺胺重氮化后，再与盐酸萘乙二胺偶合形成紫红色染料，在540 nm波长条件下比色测得亚硝酸盐含量；另一条通道采用镉柱将硝酸盐还原成亚硝酸盐，测得亚硝酸盐总量，再由测得的亚硝酸盐总量减去试样中亚硝酸盐含量，即得试样中硝酸盐含量。与上述方法相比而言，连续流动分析-盐酸萘乙二胺分光光度法自动化程度高，采用镉柱还原操作方便，检测效率高，可以在线即时查看亚硝酸盐和硝酸盐的含量。本研究建立的连续流动分析-盐酸萘乙二胺分光光度法，可以定量测定酱油中亚硝酸盐和硝酸盐，从而为制定相关酱油标准中亚硝酸盐和硝酸盐的限量指标提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酱油A（X公司生抽）、酱油B（X公司老抽）、酱油C（XX公司老抽）：市售；亚硝酸钠标准溶液（200 μg/mL，以NaNO2计）、硝酸钠标准溶液（200 μg/mL，以NaNO3计）：北京海岸鸿蒙标准物质技术有限责任公司；磺胺（纯度＞99.0%）：梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；镉粒、聚氧乙烯月桂醚溶液：荷兰Skalar公司；亚铁氰化钾、乙酸锌、冰乙酸、硼酸钠、氯化铵、乙二胺四乙酸二钠、氨水、磷酸、盐酸萘乙二胺（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

San++连续流动分析仪：荷兰Skalar公司；Elmasonic P型超声提取器：德国Elma公司；SW22型恒温振荡水浴槽：德国Julabo公司。

1.3 试验方法

1.3.1 溶液配制

亚铁氰化钾溶液（106 g/L）：称取106.0 g亚铁氰化钾，用水溶解，并稀释至1 000 mL。

乙酸锌溶液（220 g/L）：称取220.0 g乙酸锌，加30 mL冰乙酸溶解，用水稀释至1 000 mL。

饱和硼砂溶液（50 g/L）：称取10.0 g 硼酸钠，溶于200 mL热水中，冷却后备用。

载液（R1）：称取85.0 g 氯化铵和1.0 g乙二胺四乙酸二钠溶于800 mL水中，混合均匀，用氨水调节pH至8.5±0.1，用水定容至1 000 mL，加入1 mL聚氧乙烯月桂醚溶液。

显色液（R2）：将100.0 mL 磷酸加入600 mL水中，再加入10.0 g磺胺和1.0 g 盐酸萘乙二胺，搅拌至全部溶解，用水定容至1 000 mL。

亚硝酸盐和硝酸盐标准工作液：准确量取亚硝酸钠标准溶液和硝酸钠标准溶液各5.0 mL于200 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，得5.0 μg/mL亚硝酸盐标准工作液和5.0 μg/mL硝酸盐标准工作液。

亚硝酸盐和硝酸盐标准使用液：分别移取亚硝酸盐和硝酸盐标准工作液，加水稀释，配制成系列标准使用液，亚硝酸盐质量浓度分别为0.025 mg/L、0.05 mg/L、0.10 mg/L、0.30 mg/L、0.50 mg/L、1.0 mg/L；硝酸盐质量浓度分别为0.25mg/L、0.50mg/L、1.00mg/L、2.00mg/L、2.50mg/L、5.00mg/L。

1.3.2 样品前处理

准确量取2.0 mL试样于试管中，加入2.0 mL饱和硼砂溶液，加入25.0 mL水并摇匀，于超声提取器中提取15 min，加入2.0 mL亚铁氰化钾溶液和2.0 mL乙酸锌溶液，静置，待恢复至室温后定容至50.0 mL。在室温条件下以6 000 r/min离心5 min后过滤，滤液备用。同时做试剂空白。

1.3.3 标准曲线及样品测定

（1）标准曲线的绘制

分别将亚硝酸盐和硝酸盐标准使用液置于进样杯中，由进样器按程序依次取样、测定。以测定信号值（峰高）为纵坐标，对应的亚硝酸盐质量浓度（以NaNO2计，mg/L）或硝酸盐质量浓度（以NaNO3计，mg/L）为横坐标，绘制亚硝酸盐、硝酸盐标准曲线。

（2）试样溶液的测定

将试剂空白和试样溶液按照上述方法进行测定，得到试剂空白和试样溶液的信号值（峰高），根据标准曲线得到待测液中亚硝酸盐（以NaNO2计）或硝酸盐（以NaNO3计）的质量浓度。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

根据1.3.3中所述方法分别对亚硝酸盐和硝酸盐标准使用液进行测定，以标准物的质量浓度（X）为横坐标，峰高（H）为纵坐标绘制标准曲线，标准曲线回归方程、相关系数、线性范围见表1。从表1可以看出，连续流动分析-盐酸萘乙二胺分光光度法测定亚硝酸盐和硝酸盐分别在0.025～1.0 mg/L、0.25～5.0 mg/L范围内具有良好的线性关系，线性相关系数R2均＞0.999。

表1 标准曲线的线性回归方程及相关系数Table 1 Linear regression equations and correlation coefficients of standard curves

2.2 样品提取条件的优化

选取酱油B采用25 ℃振荡15 min、100 ℃水浴加热15 min、25 ℃超声15 min进行3平行提取，分别测定其亚硝酸盐及硝酸盐含量，结果见表2。由表2可知，采用25 ℃超声15 min后测得的亚硝酸和硝酸盐含量均明显高于另外两种提取条件，提取效率较高，同时相比100 ℃水浴加热15 min后不需要长时间冷却至室温，试验操作简单方便。因此，选取25 ℃超声15 min作为酱油中亚硝酸盐和硝酸盐的提取条件。

表2 不同提取条件下酱油中的亚硝酸盐和硝酸盐含量Table 2 Contents of nitrite and nitrate in soy sauce under different extraction conditions

注：数据为平均值±标准误差（n=3）。下同。

2.3 回收率与精密度试验

在3种酱油中分别添加3个不同浓度（低、中、高）的亚硝酸盐标准溶液和硝酸盐标准溶液，按照前述方法进行样品前处理后采用连续流动分析-盐酸萘乙二胺分光光度法测定，每个浓度平行测定7次，分别计算亚硝酸盐和硝酸盐的加标回收率，同时计算出精密度试验结果相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），结果分别见表3和表4。由表3和表4可知，亚硝酸盐的加标回收率在83.54%～98.56%，硝酸盐的加标回收率在92.95%～102.32%，同时亚硝酸盐的精密度试验结果RSD在1.06%～2.51%，硝酸盐的精密度试验结果RSD在0.53%～1.22%，满足国标GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范食品理化检测》标准中检测方法确认的技术要求，这表明该方法具有很好的准确性和精密度良好，可以满足检测分析要求。

表3 酱油中亚硝酸盐测定加标回收率和精密度试验结果Table 3 Results of standard recovery rates and precision tests of nitrite in soy sauce

表4 酱油中硝酸盐测定加标回收率和精密度试验结果Table 4 Results of standard recovery rates and precision tests of nitrate in soy sauce

2.4 酱油中亚硝酸盐和硝酸盐的测定

由表3和表4可知，3种酱油中亚硝酸盐含量为0.293～0.646 mg/kg，硝酸盐含量为10.25～27.83 mg/kg，充分说明3种酱油样品中确实存在一定量的亚硝酸盐和硝酸盐，而且酱油B中的硝酸盐含量相对较高。酱油在发酵生产过程中一般不会有亚硝酸盐和硝酸盐产出，而某些酱油产品中亚硝酸盐和硝酸盐含量相对较高，可能与发酵后产品的调配有关（如焦糖色素的添加），因此对酱油中亚硝酸盐和硝酸盐的限量值作出明确规定很有必要。

3 结论

本研究建立了一种同时检测酱油中亚硝酸盐和硝酸盐的连续流动分析-盐酸萘乙二胺分光光度法，采用超声直接提取，同时以乙酸锌-亚铁氰化钾体系作为沉淀剂，操作简单方便，自动化程度高。通过对回收率和精密度等指标的考查，结果均显示良好，表明采用连续流动分析-盐酸萘乙二胺分光光度法可以准确、高效地测定酱油中亚硝酸盐和硝酸盐。此外，本研究建立的连续流动分析-盐酸萘乙二胺分光光度法也可以用于食品中亚硝酸盐和硝酸盐的检测，具有应用广泛、操作简便、灵敏度和准确度高等特点，尤其在水质检测和肉制品检测中应用较多，而目前采用双通道同时测定食品中亚硝酸盐和硝酸盐含量的方法较少，可以进一步扩展用于一些重色的酱制产品（非指肉制品）的亚硝酸盐和硝酸盐含量的测定，具有一定的实际应用意义。