葫芦茶苷体内抗鸭乙型肝炎病毒及保肝作用研究＊

唐爱存，卢秋玉，韦燕飞，谢海源，刘喜华

（1. 广西中医药大学第一附属医院 南宁 530023；2. 广西壮瑶药技术研究中心 南宁 530200；3. 广西壮族自治区人民医院 南宁 530021；4. 广西中医药大学 南宁 530001；5. 广西卫生职业技术学院 南宁 530023）

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是世界范围重大的公共卫生问题之一，全球约20亿人感染HBV，慢性HBV 携带者约3.5 亿，我国有50%-70%的人群受过HBV 的感染，约8%-12%的人群为HBV 的携带者，估计约9300 万人为慢性HBV 感染[1]。乙型肝炎病毒慢性持续性感染可引起慢性肝炎、肝硬化和原发性肝癌，对人类的健康造成了严重危害。目前由于乙肝的发病机制尚未彻底明确，抗HBV 化学药物易于耐药、复发，疗效有待提高[2]。中医药民族医药在防治乙肝方面具有独特的疗效，因此，采用中药有效单体、复方制剂等多种途径进行抗乙肝病毒的治疗，具有广阔的前景[3]。

葫芦茶为豆科植物葫芦茶Tadehagi triquetrum(L.)Ohashi 的枝叶，主要分布在广西、广东、海南等地，是广西常用壮药材，壮名Gohuzluzcaz.，曾收载于《中华人民共和国药典》（1977年版）。葫芦茶性凉，味苦涩，具清热解毒，利湿退黄，消积杀虫功效，临床上常用于感冒发热、咽喉肿痛、肺痈、黄疸肝炎、肠炎、风湿关节痛、小儿疳积等[4-5]。前期临床研究发现[6-7]葫芦茶或葫芦茶复方治疗乙型肝炎病毒具有显著疗效，但其抗乙型肝炎病毒的物质基础及作用机制不明。葫芦茶苷（3，5－二羟基苯基－6－O－反式－对羟基肉桂酰基－β－D－葡萄吡喃糖苷），为本课题组从葫芦茶中分离得到的酚类成分，具有显著的保肝作用以及体外抗乙肝病毒活性[8-10]，有可能为葫芦茶临床抗乙肝的活性成分。本研究以感染乙肝病毒的广西麻鸭为动物模型，进一步验证考察葫芦茶苷体内抗乙肝病毒作用及其保肝作用。

1 材料

1.1 药物与试剂

葫芦茶苷（由本课题组从葫芦茶（Tadehagi triquetrum(L.)Ohashi）中分离制备，纯度＞98.0 %，临用前用2% CMC－Na 溶解成混悬液）。拉米夫定（3TC）（葛兰素-史克制药（苏州）有限公司产品，批号：15120034）。HBsAg 和HBeAg 酶联免疫检测试剂盒（上海荣盛生物技术有限公司，批号分别为20170703和20170812）；SYBR Premix Ex TaqTM：宝生物工程（大连）有限公司；ALT，AST、SOD、GSH-PX、GSH、MDA 检测试剂盒（均购自南京建成生物工程研究所，批 号 分 别 为 20160111，20160111，20160111，20160121，20160116，20160116）。

1.2 动物

广西1 天龄麻鸭，雌雄不限，体重50 ± 5 g，购自广西畜牧种苗场，动物生产许可证号SYKG 桂2003-0003。常规自由饮水喂养（温度25 ± 2℃，湿度70 ±5%，12 h光暗循环，饲料和水均由动物自由摄取）。

1.3 仪器

实时荧光定量PCR 仪（美国ABI 公司，7900 型）；自动酶标仪（美国Bio-Rad 公司，Model 680）；电子分析天平（德国Startorius 公司，BP190S）；紫外可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司，UV－3200S）；高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂，5810R型）；低压电泳仪（北京六一公司，DYY-7C）；凝胶电泳成像分析系统（以色列DNR公司，MicroChemi 4.2）。

2 方法

2.1 鸭乙肝动物模型的建立[11]

采用健康1日龄广西麻鸭，通过颈静脉注射鸭乙肝病毒强阳性血清0.1 ml。常规饲养1周后，分别从颈静脉采血，4000 r·min-1离心5 min，取血清，严格按照聚合酶链式反应（PCR）法加入裂解液并逆转录合成cDNA，取cDNA模板2 μl，10 μM的上下游引物各l μl，2×PCR Taq Mix 10 μl，总反应体系为20 μl，反应条件：94 ℃预变性10 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共反应40个循环。

2.2 实验分组及用药

将50 只感染乙型肝炎病毒鸭随机分为5 组，每组10 只，即为模型组、阳性对照组（拉米夫定50 mg·kg-1）、葫芦茶苷低中高剂量组（3，6，12 mg·kg-1）[9]，各组动物在同样条件下饲养，每日灌胃给药1次，连续给药14 天，模型组每天灌服蒸馏水，末次灌胃给药4 h 后，分别从颈静脉采血，每只采血1.5 ml左右，4000 r·min-1离心5 min分离血清，-20 ℃保存备用。

2.3 ELISA法检测DHBsAg和DHBeAg滴度

采用自动酶标仪严格按试剂盒说明书检测各组OD 值，检测波长为450 nm，参考波长为630 nm，并计算葫芦茶苷对DHBeAg，DHBsAg表达的抑制率。

抑制百分率%=[1-实验组OD值/模型组OD值]×100%

2.4 FQ-PCR法检测各组DHBV DNA的含量

采用直接加热法提取DHBV DNA，每次取鸭血清100 μ1，沸水浴10 min，10000 rpm 离心5 min，取上清液2 μ1 用于实验。依次加入9.5 μ1 ddH2O，12.5 μ1 SYBR Premix Ex TaqTM2×，FP 和RP 各0.5 μ1（根据GenBank鸭HBV 基因序列设计引物FP：5′-AACCATTGAAGCAATCACTAGAC-3′；RP：5′-ATCTATGGTGGCTGCTCGAACTA-3′。由上海生工生物工程有限公司合成)，再加入鸭血清提取物2 μ1，总体积为25.0 μ1作为FQ-PCR 反应体系。FQ-PCR 反应条件为变性10 s（95℃)，退火20 s（55℃)，延伸30 s（72℃)。共反应45个循环。

2.5 肝功能生化指标的检测

按试剂盒说明书分别检测鸭血清ALT 和AST 的变化情况。处死动物剖取鸭肝脏，取0.1 g左右的肝组织，精密称重后放入置有生理盐水的匀浆器中，在冰浴中制备成10%的肝匀浆，分别按试剂盒说明书测定SOD、GSH-PX活性和GSH、MDA的含量。

2.6 HE染色法观察鸭肝组织病理学变化

处死动物剖取肝脏，在鸭肝脏相同部位切取肝组织，用10%甲醛溶液固定，石蜡包埋切片，采用HE 染色，通过显微镜观察各组病理变化。

2.7 统计学处理

应用SPSS 19.0 软件进行统计学处理，数据采用±s表示，组间比较采用t检验，多组均数比较采用方差分析，P＜0.05有统计学意义。

表1 葫芦茶苷对DHBsAg和DHBeAg表达的影响（±s, n = 10)

表1 葫芦茶苷对DHBsAg和DHBeAg表达的影响（±s, n = 10)

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

DHBeAg/(OD值)0.186±0.0360.099±0.015**0.092±0.014**0.108±0.020**0.121±0.026*组别模型组拉米夫定葫芦茶苷剂量/(mg·kg-1)—501263 DHBsAg/(OD值)0.358±0.0620.203±0.038 **0.197±0.035**0.225±0.039**0.256±0.044*

表2 葫芦茶苷对鸭血清DHBV DNA的抑制作用（±s, n = 10）

表2 葫芦茶苷对鸭血清DHBV DNA的抑制作用（±s, n = 10）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

DHBV DNA治疗后1.62±0.240.58±0.16**0.39±0.11**0.59±0.18**0.98±0.23*组别模型组拉米夫定葫芦茶苷剂量/(mg·kg-1)—501263 DHBV DNA治疗前1.53±0.251.55±0.231.60±0.371.48±0.191.50±0.22

3 结果

3.1 葫芦茶苷对DHBsAg和DHBeAg表达的影响

结果显示，给药后葫芦茶苷3，6，12 mg·kg-1剂量组能显著抑制鸭血清中DHBsAg 和DHBeAg 的表达，与模型组比较，结果有显著性差异（P＜0.05，P＜0.01)，且随着剂量的增加，抑制效果越明显。结果见表1。

3.2 葫芦茶苷对鸭血清DHBV DNA的抑制作用

结果显示，治疗前模型组、阳性对照组和葫芦茶苷各剂量组鸭血清DHBV DNA 拷贝数无明显差异（P＞0.05)，灌胃给药治疗14 天后，拉米夫定组和葫芦茶苷3，6，12 mg·kg-1剂量组能显著抑制鸭血清DHBV DNA 的含量，与模型组比较，结果有显著性差异(P＜0.05，P＜0.01)(表2)。

表3 葫芦茶苷对鸭血清AST与ALT活性的影响（±s, n = 10)

表3 葫芦茶苷对鸭血清AST与ALT活性的影响（±s, n = 10)

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

组别模型组拉米夫定葫芦茶苷剂量/(mg·kg-1)—501263 AST/(U·L-1)156.73±32.5890.21±20.36**86.06±18.95**105.84±25.34**118.37±26.85*ALT/(U·L-1)68.52±12.8942.18±8.76**35.24±8.82**44.36±9.75**51.07±11.06*

3.3 葫芦茶苷对鸭血清AST和ALT活性的影响

结果显示，经过灌胃给药治疗14 天后，拉米夫定组和葫芦茶苷3，6，12 mg·kg-1剂量组能显著降低鸭血清ALT 和AST 的活性，与模型组比较差别有统计意义（P＜0.05，P＜0.01）。并呈现出一定的剂量依赖性(表3)。

表4 葫芦茶苷对SOD、GSH-PX活性和GSH、MDA含量的影响（±s, n = 10）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

MDA/(nmol·mg-1)54.95±11.0335.06±6.58**34.84±5.47**40.16±7.99**43.67±9.04*组别模型组拉米夫定葫芦茶苷剂量/(mg·kg-1)—501263 SOD/(U·mg-1)215.56±39.21281.25±42.85**301.72±55.79**266.43±50.03**239.54±41.22*GSH-PX/(U·mg-1)126.51±23.64189.33±30.66**201.07±41.08**161.27±29.55*143.58±20.21*GSH/(mg·g-1)21.62±4.3234.55±5.68**37.28±6.03**30.41±6.14*28.77±4.89*

3.4 葫芦茶苷对鸭肝组织匀浆SOD、GSH-PX 活性和GSH、MDA含量的影响

结果显示，经过灌胃给药治疗14 天后，拉米夫定组和葫芦茶苷3，6，12 mg·kg-1剂量组能均能显著降低鸭肝组织MDA 含量，增加鸭肝组织SOD，GSH-PX 活性和GSH 含量，与模型组比较差别有统计意义（P＜0.05 或P＜0.01)(表4)。

3.5 葫芦茶苷对鸭肝组织病理变化的影响

病毒性肝炎主要病理改变是肝细胞变性(中重度水变性或脂肪变性)及坏死，间质性炎等。结果显示，模型组鸭肝细胞出现明显肿大膨胀，肝细胞水肿，重度弥漫性脂肪变化，大部分肝细胞水肿样和气球样变性，汇管区出现炎细胞浸润，点状坏死灶；葫芦茶苷高剂量组（12 mg·kg-1）与拉米夫定阳性组（50 mg·kg-1）鸭肝细胞小叶结构清楚，肝细胞变性和坏死不明显；葫芦茶苷中剂量组（6 mg·kg-1）肝细胞弥漫性轻度脂肪性病变，鸭肝细胞气球样变性很少；葫芦茶苷低剂量（3 mg·kg-1）组肝细胞可见少量浸润的炎症细胞，肝细胞弥漫性中度脂肪性病变，部分肝细胞产生气球样变性，中央静脉周围的肝细胞核浓染成黑色固缩，分布散在。结果见图1。

图1 葫芦茶苷对鸭肝组织病理变化的影响（HE,×200）

4 讨论

本研究以感染乙肝病毒的广西麻鸭为动物模型，进一步验证发现了葫芦茶苷具有体内抗乙肝病毒作用、抗氧化作用与保肝作用，其可能为葫芦茶及葫芦茶复方临床抗乙肝的活性成分之一。作为证据，葫芦茶苷显著降低血清DHBsAg 和DHBeAg 的滴度以及DHBV DNA 的含量，体内可抑制鸭乙肝病毒；葫芦茶苷降低鸭血清ALT 与AST 活性，减轻肝细胞损伤程度，可保护肝细胞；此外，葫芦茶苷增加肝组织SOD、GSH-PX 活性和GSH 含量，减少MDA 含量，对抗氧化应激。

本研究采用鸭乙型肝炎病毒实验动物模型，可模拟人类乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)。HBV 是一种比较严格嗜肝DNA 病毒，具有独特结构和明显的种属特异性，其感染的宿主范围狭窄[12]。鸭乙型肝炎病毒(DHBV)属于嗜肝DNA 病毒科，其在病毒复制、基因序列、形态结构、致病机理等方面与人类乙肝病毒较为相似[13]。广西麻鸭易于感染鸭乙型肝炎病毒，容易建立DHBV 持续感染状态，建立的体内实验模型与HBV 感染相近似，其病程较规律，病毒血症持续时间较长且较稳定，无明显的自然转阴现象，保证了模型的稳定性和可靠性[14]。HBV DNA 是乙型肝炎病毒存在与复制的直接标志，定量检测是衡量乙型肝炎传染性的最精确指标，FQ-PCR 法是检测其最敏感的技术之一，能准确灵敏地反映乙型肝炎病毒感染和治疗恢复的情况。本研究通过定量检测，发现葫芦茶苷显著降低血清DHBsAg 和DHBeAg 的滴度以及DHBV DNA的含量，体内可抑制鸭乙肝病毒，与其前期体外抑制乙肝病毒活性一致，并与临床抗乙肝疗效相关。

此外，本研究发现，葫芦茶苷降低鸭血清ALT 与AST活性，减轻肝细胞损伤程度，可保护肝细胞；此外，葫芦茶苷增加肝组织SOD、GSH-PX活性和GSH含量，减少MDA含量，对抗氧化应激。感染乙型肝炎病毒的过程，伴随着免疫应答的产生，免疫应答的同时会引起肝脏细胞损害和坏死，导致肝功能损害，肝组织坏死，转氨酶等指标异常[15]。SOD 能消除机体在新陈代谢过程中产生的有害物质，特别是清除自由基的关键酶，其水平的高低是衡量机体衰老与死亡的直观指标。MDA 是体外影响线粒体呼吸链复合物及线粒体内关键酶，是自由基引发的脂质过氧化终末代谢产物，肝组织中MDA 含量增多表明过氧化损伤程度加重，因此测定MDA值能反映氧自由基的含量和脂质过氧化程度。本研究再次验证了葫芦茶苷的保肝降酶作用，并发现抗氧化机制可能部分参与了保肝作用。

综上，葫芦茶苷对鸭乙型肝炎病毒DNA 以及其分泌的DHBsAg 和DHBeAg 具有显著的抑制作用，并能减轻肝细胞损伤程度，对DHBV 引起肝损伤具有保护作用，但其抗乙型肝炎病毒的分子作用机制、药物代谢动力学、安全性等有待进一步考察，以为开发应用壮药葫芦茶，进一步提供理论基础和实验依据。