彭 俊,王 英,蒋鹏飞,刘家琪,潘 坤,周亚莎,徐 剑,彭清华1,
(1. 湖南中医药大学第一附属医院 长沙 410007;2. 湖南中医药大学 长沙 410208;3. 中医药防治眼耳鼻咽喉疾病湖南省重点实验室 长沙 410208)
原发性视网膜色素变性(Retinitsi Pigmentosa,RP)是一组以进行性光感受细胞及视网膜色素上皮功能丧失为共同表现的遗传性视网膜变性疾病,本病以夜盲、进行性视野损害、眼底色素沉着和视网膜电图异常或者无波形为主要临床特征[1],中医称为“高风内障”。本研究选择皇家外科学院大鼠(Royal College of Surgeons rat,RCS)灌胃建模,通过免疫组化、RT-PCR、WB 检测Bcl-2、Bid 表达,在抗细胞线粒体凋亡途径层面上探讨枸杞、丹参对RP 模型大鼠RCS(rdy-/-,p-/-)大鼠的干预效果。
1.1.1 实验动物
RCS(rdy-/-,p-/-)大鼠,32 只,雌性、雄性均16只,质量140-160 g,鼠龄28-42 d,空白对照:RCS(rdy+/+,p+/+)大鼠8 只,鼠龄28-42 d(并与RCS(rdy-/-,p-/-)大鼠鼠龄匹配),雌性、雄性各4只,质量200-240 g。昭衍(苏州)新药研究中心有限公司提供,SPF 级。 质 量 合 格 证 号:NO. 201512444,NO.201600559。饲养于湖南中医药大学动物实验中心SPF 房,室温22℃± 2℃,湿度50%-55%,定期更换垫料,自由饮食。
1.1.2 实验药品
枸杞子中药配方颗粒,每袋装3.0 g(相当于临床使用量饮片10 g),生产厂家:广东一方制药有限公司,许可证号:粤20110214,产品批号:5103761。丹参中药配方颗粒,每袋装1.8 g(相当于临床使用量饮片10 g),生产厂家:广东一方制药有限公司,产品批号:5100631。
1.1.3 实验试剂
苯巴比妥钠(湖南中医药大学病理实验室提供)、4%多聚甲醛(湖南中医药大学病理实验室提供)、Harris 苏木素(北京中杉金桥生物技术公司提供)、二抗试剂盒(北京中杉金桥生物技术公司提供)、DAB 试剂盒(北京中杉金桥生物技术公司提供)、3%过氧乙酸(北京中杉金桥生物技术公司提供)、Bcl-2 抗体(武汉博士得生物工程有限公司提供)、Bid 抗体(武汉博士得生物工程有限公司提供)、APS(美国Sigma公司提供)、SDS(美国Sigma 公司提供)、TEMED(美国Sigma公司提供)。
1.1.4 实验器材
轮转石蜡切片机,数码医学图像分析系统(型号:Motic 6.0),台式冷冻离心机,荧光定量RCP 仪,荧光PCR板,电泳仪等。
1.2.1 分组方法
采用随机数字表法将RCS(rdy-/-,p-/-)雌性及雄性大鼠均随机分为4 组(n=8),分别为:模型组、枸杞组、丹参组和枸杞加丹参组(杞参组)四组,每组雌雄均4 只,共8 只;选择鼠龄及性别匹配的RCS(rdy+/+,p+/+)大鼠雌雄各4 只,共8 只:为空白对照组。
1.2.2 动物给药方法
所有RCS大鼠适应性饲养1周后给予灌胃。药物及剂量如下:空白组、模型组大鼠以0.9%生理盐水12 mL/kg 灌胃;枸杞组:10 g 枸杞提取物溶于50 mL 灭菌蒸馏水中,则枸杞浓度为0.2 g/mL,大鼠灌胃剂量为1.08 g/kg·d。(雄性大鼠灌胃量为1.5 mL/d,雌性大鼠为1 mL/d);丹参组:10 g 丹参提取物溶于40 mL 灭菌蒸馏水中,则丹参浓度为0.25 g/mL,灌胃剂量为1.35 g/kg·d。(雄性大鼠灌胃量为1.5 mL/d,雌性大鼠为1 mL/d);杞参组:10 g 枸杞及10 g 丹参溶于40 mL 灭菌蒸馏水中,则药物浓度为0.5 g/mL,大鼠灌胃剂量为2.43 g/kg·d。(雄性大鼠灌胃量为1.5 mL/d,雌性大鼠为1 mL/d)。所有动物给药剂量按“人-动物体表面积等效剂量比值表”折算,折算系数W =0.018,折算公式:W ×成人用量(g)/动物体重(kg)。所有RCS(rdy-/-,p-/-)雌性、雄性大鼠及RCS(rdy+/+,p+/+)雌性、雄性大鼠均灌胃28天。
1.2.3 取材方法
取材时相为灌胃第28 天结束后1 天。1%苯巴比妥钠3.5 mL/kg 腹腔注射麻醉,麻醉满意后,75%酒精消毒RCS 大鼠双眼眼睑周围,眼科弯组织剪直接分离球周组织,剪断视神经后摘除眼球,置于冰浴的1 ×PBS溶液中清洗眼球周围血液。解剖显微镜视野操作台区,光口玻璃皿置于冰块上,将眼球放于玻璃皿中,眼科显微剪沿角巩膜缘剪开,去除眼前节,小心拭除玻璃体,用眼科显微镊子剥离出视网膜组织,保存于-80℃冰箱中,供WB及PCR检测Bcl-2、Bid表达。
1.3.1 免疫组化法检测RCS 大鼠视网膜Bcl-2、Bid 表达
图1 RCS(rdy+/+,p+/+)大鼠空白组BCL-2
图2 RCS(rdy-/-,p-/-)大鼠模型组BCL-2
图3 RCS(rdy-/-,p-/-)大鼠枸杞组BCL-2
高倍镜下观察Bcl-2、Bid 蛋白的表达情况,判断标准:免疫组化反应后阳性标记的细胞胞浆着色呈棕色或深棕色。高倍镜下随机选取5个视网膜视野,用图像分析系统进行图像分析处理。
1.3.2 RT-qPCR 检 测RCS 大 鼠 视 网 膜Bcl-2、Bid mRNA表达
1.3.3 Western Blot(WB)法检测RCS大鼠视网膜Bcl-2、Bid蛋白相对表达量
剪取100 mg 视网膜组织,用冰预冷PBS 清洗组织,加入125 μL RIPA 裂解液于匀浆器中反复研磨组织直至看不见组织块;冰上,蛋白裂解30 min;4℃,12000 rpm 离心15 min。(提前开离心机预冷);将离心后的上清分装转移倒0.5 mL 的离心管中,部分用于实验,多余的存于-20℃;按照BCA 蛋白定量试剂盒(Wellbio)使用说明操作,测定蛋白浓度。
采用统计学软件SPSS 23.0分析实验数据,根据不同的数据特点采用不同的检验法:计数资料采用χ2检验;计量资料以±s表示,两组比较,如果满足正态及方差齐性,采用成组t检验,不满足者采用秩和检验;多组比较,满足正态及方差齐性,采用ANOVA(LDS)分析,不满足者采用秩和检验。P<0.05 认为差异有统计学意义。
2.1.1 RCS大鼠视网膜Bcl-2蛋白
RCS(rdy+/+,p+/+)大鼠空白组:视网膜全层厚度正常,神经节纤维层,内、外核层等各层以及视网膜色素上皮层结构排列有序,形态规则。视网膜上Bcl-2蛋白阳性表达较少,视网膜各层散在可见(图1)。
RCS(rdy-/-,p-/-)大鼠模型组:大鼠视网膜明显较RCS(rdy+/+,p+/+)大鼠视网膜各层结构紊乱萎缩变薄,尤其以外层视网膜变化显著。病变主要位于视网膜外层,视锥、视杆细胞萎缩变性。视网膜HE 染色图片上,视网膜色素上皮条带的连续性破坏,大部分RCS(rdy-/-,p-/-)大鼠视网膜色素上皮条带丧失。视网膜外层结构紊乱变薄,部分外核层光感受器感觉纤毛层完全萎缩消失,光感受器细胞核数目减少,形态不规则,小部分区域核染色集聚成团,大部分区域未见外层光感受器细胞核染色。脉络膜组织空泡现象增多。视网膜内层组织可见少量点状黑色素颗粒。视网膜上Bcl-2蛋白阳性表达非常少。见下图2。
RCS(rdy-/-,p-/-)大鼠枸杞组:RCS(rdy-/-,p-/-)枸杞组脉络膜空泡现象较RCS(rdy-/-,p-/-)模型组大鼠减少。其余RCS(rdy-/-,p-/-)枸杞组大鼠视网膜各层组织结构同RCS(rdy-/-,p-/-)模型组大鼠结构类似。视网膜上Bcl-2 蛋白阳性表达较RCS(rdy-/-,p-/-)大鼠模型组略多。见图3。
RCS(rdy-/-,p-/-)大鼠丹参组:RCS(rdy-/-,p-/-)丹参组大鼠脉络膜空泡现象较RCS(rdy-/-,p-/-)模型组大鼠减少。其余RCS(rdy-/-,p-/-)丹参组大鼠视网膜各层组织结构同RCS(rdy-/-,p-/-)模型组大鼠结构类似。视网膜上Bcl-2 蛋白阳性表达较RCS(rdy-/-,p-/-)大鼠模型组略多。见图4。
RCS(rdy-/-,p-/-)大鼠枸杞加丹参组:RCS(rdy-/-,p-/-)杞参组大鼠视网膜厚度明显较RCS(rdy-/-,p-/-)模型组大鼠视网膜厚度增加,视网膜色素上皮条带部分可见,部分外核层光感受器感觉纤毛层部分可见,光感受器细胞核数目较RCS(rdy-/-,p-/-)模型组多。脉络膜组织空泡现象较RCS(rdy-/-,p-/-)模型组大鼠减少。视网膜上Bcl-2 蛋白阳性表达较RCS(rdy-/-,p-/-)大鼠模型组明显增多。见图5。
图4 RCS(rdy-/-,p-/-)大鼠丹参组BCL-2
图5 RCS(rdy-/-,p-/-)大鼠杞参组BCL-2
2.1.2 RCS大鼠视网膜Bid蛋白
RCS(rdy+/+,p+/+)大鼠空白组:视网膜全层厚度正常,神经节纤维层,内、外核层等各层以及视网膜色素上皮层结构排列有序,形态规则。视网膜组织上Bid 蛋白阳性表达少量散在可见,视网膜各层可见。见下图6。
图6 RCS(rdy+/+,p+/+)大鼠空白组Bid
RCS(rdy-/-,p-/-)大鼠模型组:大鼠视网膜明显较RCS(rdy+/+,p+/+)大鼠视网膜各层结构紊乱萎缩变薄。病变主要位于视网膜外层,视锥、视杆细胞萎缩变性。视网膜HE染色图片上,视网膜色素上皮条带的连续性破坏,大部分RCS(rdy-/-,p-/-)大鼠视网膜色素上皮条带丧失。视网膜外层结构紊乱变薄,部分外核层光感受器感觉纤毛层完全萎缩消失,光感受器细胞核数目减少,形态不规则,小部分区域核染色集聚成团,大部分区域未见外层光感受器细胞核染色。脉络膜组织空泡现象增多。视网膜内层组织可见少量点状黑色素颗粒。视网膜上Bid 蛋白阳性表达大量可见,视网膜各层可见,以视网膜外层为主。见下图7。
RCS(rdy-/-,p-/-)大鼠枸杞组:RCS(rdy-/-,p-/-)枸杞组脉络膜空泡现象较RCS(rdy-/-,p-/-)模型组大鼠减少。其余RCS(rdy-/-,p-/-)枸杞组大鼠视网膜各层组织结构同RCS(rdy-/-,p-/-)模型组大鼠结构类似。视网膜上Bid 蛋白阳性表达较RCS(rdy-/-,p-/-)大鼠模型组略少。见图8。
RCS(rdy-/-,p-/-)大鼠丹参组:RCS(rdy-/-,p-/-)丹参组大鼠脉络膜空泡现象较RCS(rdy-/-,p-/-)模型组大鼠减少。其余RCS(rdy-/-,p-/-)丹参组大鼠视网膜各层组织结构同RCS(rdy-/-,p-/-)模型组大鼠结构类似。视网膜上Bid 蛋白阳性表达较RCS(rdy-/-,p-/-)大鼠模型组略少。见图9。
RCS(rdy-/-,p-/-)大鼠枸杞加丹参组:RCS(rdy-/-,p-/-)杞参组大鼠视网膜厚度明显较RCS(rdy-/-,p-/-)模型组大鼠视网膜增厚,视网膜色素上皮条带部分可见,部分外核层光感受器感觉纤毛层部分可见,光感受器细胞核数目较RCS(rdy-/-,p-/-)模型组多。脉络膜组织空泡现象较RCS(rdy-/-,p-/-)模型组大鼠减少。视网膜上Bid 蛋白阳性表达较RCS(rdy-/-,p-/-)大鼠模型组明显减少。但较RCS(rdy+/+,p+/+)大鼠空白对照组多。见图10。
2.2.1 RCS 大鼠视网膜Bcl-2、Bid 扩增曲线及熔解曲线
RCS 大鼠视网膜组织Bcl-2mRNA、BidmRNA、actinmRNA 扩增曲线分别见图11、图12、图13。RCS大鼠视网膜组织BCL-2mRNA、BidmRNA、actinmRNA熔解曲线分别见图14、图15、图16。
2.2.2 灌胃后各组视网膜组织Bcl-2mRNA 相对表达量
RCS 大鼠各组灌胃后视网膜组织Bcl-2mRNA 相对表达量各组数据输入SPSS 23.0统计软件进行分析,RCS(rdy-/-,p-/-)枸杞加丹参组大鼠视网膜组织Bcl-2mRNA 相对表达量为1.08594617±0.650080305,明显高 于RCS(rdy-/- ,p-/-)模 型 组0.40991731 ±0.497733621,行单因素ANOVA LSD 检验,差异有统计学意义(aP=0.015<0.05)。且RCS(rdy-/-,p-/-)枸杞加丹参组大鼠视网膜组织Bcl-2mRNA 相对表达量更接近RCS(rdy+/+,p+/+)大鼠空白对照组。结果见表1、表2、图17。
图7 RCS(rdy-/-,p-/-)大鼠模型组Bid
图8 RCS(rdy-/-,p-/-)大鼠丹参组Bid
图9 RCS(rdy-/-,p-/-)大鼠丹参组Bid
图10 RCS(rdy-/-,p-/-)大鼠杞参组Bid
图11 Bcl-2mRNA扩增曲线
图12 BidmRNA扩增曲线
图13 actinmRNA扩增曲线
图14 Bcl-2mRNA熔解曲线
图15 BidmRNA熔解曲线
图16 actinmRNA熔解曲线
2.2.3 灌胃后各组视网膜组织BidmRNA相对表达量
RCS 大鼠各组灌胃后视网膜组织BidmRNA 相对表达量各组数据输入SPSS 23.0 统计软件进行分析,RCS(rdy-/-,p-/-)枸杞加丹参组大鼠视网膜组织BidmRNA 相对表达量为0.16235322 ± 0.265151076,明显低于RCS(rdy-/-,p-/-)模型组0.51595146 ±0.370461223,行单因素ANOVA LSD 检验,差异有统计学意义(aP=0.034<0.05)。且RCS(rdy-/-,p-/-)枸杞加丹参组大鼠视网膜组织BidmRNA 相对表达量更接近RCS(rdy+/+,p+/+)大鼠空白对照组。结果见表3、表4、图18。
表1 各组灌胃后视网膜组织BCL-2mRNA相对表达量平均值
表2 BCL-2mRNA相对表达量方差齐性检验
图17 灌胃后各组大鼠视网膜Bcl-2mRNA相对表达量比较箱图
表3 各组灌胃后视网膜组织BidmRNA相对表达量平均值
表4 BidmRNA相对表达量方差齐性检验
图18 灌胃后各组大鼠视网膜BidmRNA相对表达量比较箱图
Western blot 分析显示,分别在蛋白相对分子质量为21KD、30KD、42KD 处有表达带,分别为Bid 蛋白、Bcl-2蛋白和β-actin蛋白的表达(如下图19)。
图19 视网膜组织中Bid、Bcl-2、Actin蛋白的表达强度
2.3.1 WB 检测各组RCS 大鼠视网膜Bcl-2 蛋白表达情况
RCS 大鼠灌胃后WB 检测各组大鼠视网膜组织中Bcl-2 蛋白相对表达量,所有数据在SPSS23.0 统计软件中分析,RCS(rdy-/-,p-/-)枸杞加丹参组大鼠视网膜Bcl-2蛋白相对表达量0.7425±0.11055,明显高于RCS(rdy-/-,p-/-)模型组0.4588 ± 0.12733,差异有明显统计学意义(aP= 0.000<0.01);RCS(rdy+/+,p+/+)空白对照组大鼠视网膜Bcl-2 蛋白相对表达量0.6075 ± 0.12635,明显高于RCS(rdy-/-,p-/-)模型组0.4588±0.12733,差异有统计学意义(bP=0.007<0.01)。且RCS(rdy-/-,p-/-)枸杞加丹参组视网膜组织中Bcl-2 蛋白相对表达量为0.7425±0.11055 接近RCS(rdy+/+,p+/+)大鼠空白对照组视网膜组织中Bcl-2 蛋白相对表达量为0.6075±0.12635。WB 检测Bcl-2 蛋白相对表达量结果与前一部分PCR 检测Bcl-2mRNA结果吻合。结果提示:用药物干预后各组Bcl-2 蛋白相对表达量均有所上升,枸杞丹参能有效促进视网膜组织中抗凋亡因子Bcl-2 蛋白表达。考虑枸杞丹参减轻视网膜色素变性疾病时视网膜细胞凋亡与增加视网膜组织中抗凋亡因子Bcl-2 蛋白表达有关。结果见表5、表6、图20。
表5 各组灌胃后视网膜组织Bcl-2蛋白相对表达量平均值
表6 Bcl-2mRNA相对表达量方差齐性检验
图20 WB检测各组RCS大鼠视网膜组织中Bcl-2相对含量比较箱图
表7 WB检测各组灌胃后视网膜组织Bid蛋白相对表达量平均值
表8 BidmRNA相对表达量方差齐性检验
2.3.2 WB 检测各组RCS 大鼠视网膜Bid 蛋白表达情况
RCS 大鼠灌胃后WB 检测各组大鼠视网膜组织中Bcl-2 蛋白相对表达量,所有数据在SPSS 23.0 统计软件中分析,RCS(rdy-/-,p-/-)枸杞加丹参组视网膜Bid蛋白相对表达量为0.4638 ± 0.05041,低于RCS(rdy-/-,p-/-)模型组0.6400±0.09666,差异有明显统计学意义(cP= 0.000<0.01);RCS(rdy-/-,p-/-)枸杞组视网膜Bid 蛋白相对表达量为0.4663 ± 0.07615,低于RCS(rdy-/-,p-/-)模型组0.6400±0.09666,差异有明显统计学意义(aP= 0.001<0.01);RCS(rdy-/-,p-/-)丹参组视网膜Bid 蛋白相对表达量为0.5438 ±0.10501,低 于RCS(rdy-/-,p-/-)模 型 组0.6400 ±0.09666,差异有明显统计学意义(bP= 0.000<0.01);且RCS(rdy-/-,p-/-)枸杞加丹参组视网膜Bid 蛋白相对表达量0.4638 ± 0.05041 更接近RCS(rdy+/+,p+/+)大鼠空白对照组视网膜Bid 蛋白相对表达量0.3550±0.05831。WB 检测Bid 蛋白相对表达量结果与前一部分PCR 检测BidmRNA 结果吻合。结果提示:用药物干预后各组促进线粒体凋亡途径的关键蛋白Bid 蛋白相对表达量均有所下调,枸杞丹参能有效减少Bid 的表达,考虑枸杞丹参减轻视网膜色素变性疾病时视网膜细胞凋亡与减少Bid的表达有关。结果见表7、表8、图21。
原发性视网膜色素变性(RP)是一组遗传性视网膜退行性疾病,大多数RP 患者在青少年发病,通常视网膜病变中周部开始,逐渐向后极部黄斑区进展。据报道,全球RP 的患病率是1/3000-7000,全世界大约有150 万RP 患者进行性视功能损害[2]。在RP 发病后的几十年,病情逐步进展,视野进行性缩窄,影响中心视力,最终导致严重失明,影响生活和工作。原发性视网膜色素变性与很多神经变性疾病一样,位于视网膜结构中的感光细胞死亡的最终共同路径为程序化死亡。
图21 WB检测各组RCS大鼠视网膜组织中Bid相对含量比较箱图
细胞调亡(Apoptosis)是指机体为了维持内环境稳定,由基因控制的细胞自主有序的死亡。细胞调亡是细胞受到机体生理性信号刺激以及内外环境条件的变化或损伤所作出的主动应答产生有序变化的死亡过程。目前,发现的细胞调亡途径主要分为三种:死亡受体途径、内质网途径和线粒体途径。死亡受体途径又称为外源性途径即膜受体途径,是各种导致细胞调亡的剌激,如病毒、细菌毒素、理化因素等,激活细胞膜表面的死亡受体,将调亡信号传导到细胞内,启动蛋白酶系统,从而引发细胞的凋亡;内质网途径机制主要包括内质网应激诱导凋亡、内质网钙离子诱导凋亡、内质网凋亡底物介导的凋亡;线粒体途径是内源性途径的主要一条,内源性途径的凋亡是由细胞内的损伤开始的,而线粒体是内源性程序化死亡信号传导途径中起关键调节作用的细胞器,线粒体是细胞能量代谢的中心,因此细胞凋亡过程中对线粒体损伤的最直接结果是其正常功能的丧失,线粒体功能障碍可以导致自由基产生增加、钙离子超载、兴奋性氨基酸释放增多引起细胞凋亡,还可直接诱导细胞凋亡。线粒体的能量储备在其中起决定性的作用,如果损伤程度相对轻微,ATP 保留以提供细胞凋亡所需的能量,则发生凋亡。
线粒体途径凋亡机制主要是线粒体上游信号分子作用于线粒体膜,例如Bcl-2 蛋白家族活化形成蛋白通道,线粒体PT 孔开放,凋亡活性物质释放引起下游Caspase 家族蛋白活化并作用于相应底物引起细胞凋亡[3]。Bcl-2 是B 细胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2)的缩写,是最早研究的与凋亡有关的一类重要的原癌基因,在凋亡的过程中,Bcl-2 起到了重要的作用。而Bcl-2 基因家族成员在细胞凋亡的线粒体途径中扮演着关键角色。这类基因家族在结构上,有一个或者多个Bcl-2 同源(Bcl-2 Homology,即BH)区域,并依此结构分为2 类:抗细胞凋亡成员(如Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-W、Mcl-1 和A1),降低线粒体外膜通透性,抑制Cyt C 的释放,在细胞存活中起着决定性作用;促凋亡成员(如Bax、Bak 和Bok)和只含有一个BH3 区域的前凋亡蛋白(如Bid、Bad、Bik、Bim和Hrk),增加线粒体外膜通透性,有利于释放Cyt c,是细胞死亡必需的成分。迄今为止,已在线虫、病毒和哺乳动物等机体中发现了20 多个Bcl-2 家族成员,这些家族成员一个最显著的特征就是具有Bcl-2 同源结构域(Bcl-2 homolog domain,BH),一些家族蛋白还有BH1 至BH4 结构域,还有一些则只有一个或者几个这样的结构域。正是由于结构域组成上的差异,使Bcl-2 家族成员具有了不同的生物学功能。典型的抗凋亡成员有Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1 等,这类Bcl-2 家族成员具有抗凋亡活性,可使细胞免于死亡。这些抗凋亡因子的共同特征就是含有完整的四个保守BH 结构域(BH1、BH2、BH3、BH4)和一个疏水的C 端尾状结构,即膜结构域。另一类Bcl-2家族的成员的最显著特性就是缺少BH4结构域并且包含BH3 结构域。它们均具有促凋亡活性,这类成员主要包括Bax、Bid 和Bak 等。BH3 是细胞凋亡的关键性结构域,Bid是Bcl-2家族中仅有BH3区域的促凋亡蛋白。在凋亡进程之前,Bid 蛋白非常均匀的分布于整个细胞质内,但当凋亡开始启动后,Bid 被凋亡通路中激活的caspase-8 切割为具有活性的tBid,从而参与线粒体通路的促凋亡效应,tBid 向线粒体的转运增加了线粒体膜的通透性,同时Bid还可以促进Bax向线粒体膜的插入和多聚体的形成。大量研究[4-7]证实,Bcl-2与Bid 亦参与了视网膜色素变性疾病视网膜细胞凋亡过程。
彭清华教授通过大量的临床观察和机理研究,证实本病虽以虚为本,但以实(瘀)为标,在其病理过程中自始至终贯穿着血瘀病理[8-15]。RP 患者为本虚夹瘀之证,临床多见虚中夹瘀证型,亦可分为阴虚夹瘀、阳虚夹瘀证型。治疗方面,基于虚中夹瘀病机,提出了“补虚活血”法来治疗视网膜色素变性疾病。补虚活血主要用枸杞、丹参两味中药。枸杞性平,归肝肾经。可滋补肝肾、益精明目,治疗肝肾阴虚证所致的视力减退、内障目昏。《本草经集注》曰:“补益精气,强盛阴道。”《药性论》记载枸杞:“补益精,诸不足,明目……”枸杞含有多种化学成分,包括糖类、氨基酸、微量元素、超氧化物歧化酶、生物碱类、无机盐及其他有机物等。其中,枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharide,LBP)是其主要化学成分。LBP 具有免疫促进及免疫调节作用,抗氧化、抗衰老作用,抗肿瘤作用、降血糖降血脂作用,具有保护生殖系统的作用[16]。研究表明,LBP 还具有抗疲劳、抗辐射、降血压和促进发育等作用[17]。丹参善长通行血脉,祛瘀止痛,常用治各种瘀血病证。《本草便读》曰:“丹参,能祛瘀以生新。”两药合用共奏益肾养肝、活血明目之功,主治肝肾阴虚、瘀血阻络所致的视网膜色素变性。丹参在心血管疾病领域应用十分广泛,现代药理研究其具有内皮修复作用、抗血小板抗凝、扩张冠脉,改善微循环作用、抗动脉粥样硬化、抗炎、保护受损心肌、抗心律失常、调节脂质代谢等作用[18]。丹参具有明显的抗凝血作用,其有效成分丹参酮类化合物在心血管方面具有抑制血小板聚集和抗血栓形成等作用,并且丹参酮类具有扩张血管,改善微循环作用[19]。
经多年临床实践及前期科学研究证实,对于肝肾阴虚、瘀血阻络等所致的虚中夹瘀证视网膜色素变性。枸杞加丹参两药合用共奏益肾养肝、活血明目之功,对视网膜色素变性患者视功能有保持和恢复的效果。故本研究采用视网膜色素变性经典动物模型RCS(rdy-/-,p-/-)大鼠为主要研究对象,在补虚活血原则指导下,给予补虚活血代表药物枸杞丹参灌胃治疗。从检测视网膜Bcl-2、Bid 表达为切入点,在抗细胞凋亡层面上,通过动物实验,采用随机对照的方法,研究枸杞、丹参对虚中夹瘀证视网膜色素变性干预作用及相应的作用环节。研究结果显示枸杞、丹参能减轻视网膜色素变性病变时有害因素导致的视网膜细胞凋亡,促进抗细胞凋亡因子Bcl-2表达,以及减少介导线粒体凋亡途径的Bid 表达,从而保护了视锥、视杆感光细胞,减少视网膜感光及神经细胞凋亡,保护视功能。
综上所述,以枸杞丹参为代表药的“补虚活血”法治疗原发性视网膜色素变性的分子生物学机制,在抗线粒体凋亡途径方面,考虑为枸杞丹参上调RCS(rdy-/-,p-/-)大鼠视网膜抑制凋亡的Bcl-2 表达并下调介导线粒体凋亡途径的Bid 表达,从而减轻视网膜色素变性经典动物模型RCS(rdy-/-,p-/-)大鼠视网膜感光及神经细胞凋亡,起到保护视功能作用。