电针后血清干预对多裂肌卫星细胞增殖、Collagen I及MMP2表达的影响＊

陈玉佩，李晓红，许 玥，徐 菁，霍则军，张 莉

（1. 北京中医药大学针灸推拿学院 北京 100029；2. 北京市丰台区南苑医院针灸按摩科 北京 100076；3. 北京中医药大学生命科学学院 北京 100029；4. 北京大学第三医院中医科 北京 100191）

腰部多裂肌是稳定腰椎的钢索，多裂肌形态的改变和功能的紊乱是腰痛的重要诱因[1-2]。骨骼肌受损原因不尽相同，但其再生修复过程基本一致[3]，是肌纤维再生和细胞外基质（Extracellular Matrix，ECM）重塑协调发挥作用的结果[4]。ECM 既可以减轻炎症反应，又可以调控肌卫星细胞（muscle satellite cell，MSCs）的生长环境，促进骨骼肌的再生修复进程[5]。MSCs 是骨骼肌组织的干细胞，它的激活、增殖是受损骨骼肌再生修复的前提条件[6]。

ECM 是存在于细胞间的结缔组织，是构成细胞物理结构、调节细胞间生物化学和生物力学信号的重要媒介，约占人体骨骼肌组织重量的10%，也是维持骨骼肌生理功能的关键，使骨骼肌能够应对内、外环境的变化[7]。由此可见，ECM 对骨骼肌生理功能的维持和病理变化的改善具有重要作用[8]。针刺治疗腰痛疗效显著，但其机制尚不十分明确。本课题组前期围绕电针“委中”穴促进损伤多裂肌再生修复的机制做了大量动物实验，发现电针“委中”干预后血清中磷酸肌酸激酶和白介素17 发生明显变化[9-10]。因此，本研究以离体培养的腰多裂肌MSCs 为研究对象、以电针“委中”穴后的血清为干预手段，观察MSCs 的增殖情况和ECM组成成分—Collagen I、MMP2蛋白表达的变化，揭示电针治疗腰多裂肌损伤的部分作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

准备25 只SPF 级雄性SD 大鼠，体重120 ± 10g ，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。许可证编号：SCXK（京）2016-0001）。于北京中医药大学屏障式实验动物房适应性饲养7 d，室温24℃，相对湿度为40%-50%。实验过程中对动物的处置符合科技部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》。

采用随机数字表法将其中24只大鼠分为正常组、模型组、电针组，每组8 只。（注：研究发现生理盐水注射的对照组与正常组之间无统计学差异[10-11]，故本研究未设模型对照组。）

1.2 主要试剂及仪器

实验的主要试剂及仪器为：布比卡因盐酸盐（BPVC（B5274-1G），SIGMA)；胎牛血清（FBS，杭州四季青公司）；DMEM 高糖培养基（Hyclone）；兔来源Collagen I 多克隆抗体（ab34710）；兔来源MMP2 多克隆抗体（10375-2-AP）；鼠单克隆抗体MyoD（ab16148）；兔来源Pax7 多克隆抗体（AF7584）；鼠多抗GAPDH 抗体、HRP山羊抗兔/鼠二抗、BCA蛋白定量检测试剂盒、DAPI 染色液（北京索莱宝科技有限公司）；Bio-Rad®蛋白质电泳及转膜系统（BIO-RAD 公司）；华佗牌针灸针（0.30 mm×13mm，苏州医疗用品厂）。

1.3 方法

1.3.1 造模方法

采用单次肌肉注射0.5%的布比卡因建立大鼠腰多裂肌损伤模型。具体制备方法参照已发表文章[12]。如图1所示。

1.3.2 处理方法

各组的具体处理方法如下：

正常组：与模型组同步抓取、固定、取材，但不造模、予电针治疗。

模型组：与电针组同步抓取、固定、取材，但不予电针治疗。

电针组：造模后24 h，以《实验针灸学》[13]实验动物穴位图谱为依据，取双侧“委中”穴（膝关节背面正中）进行电针治疗，造模后第4 d 取材。电针方法：将大鼠置于固定器上，暴露双后肢。华佗牌针灸针（0.30 ×13 mm）直刺进针约0.5～1 cm，连接韩式电针仪(HANS-200 A)，2/100 Hz 疏密波，1-2 mA 电流强度，20 min/次，1次/d，共3次。

1.3.3 制备针刺血清

造模后的第4 d，10%水合氯醛腹腔注射（350 mg/kg）麻醉，腹主动脉取血5 ml，室温静置2 h，3500 r/min离心10 min，取上清，56℃灭活30 min，无菌条件下经0.22 μm微孔滤膜过滤，-20℃保存备用。

1.3.4 原代MSCs的分离、培养、纯化

结合Ⅰ型胶原酶消化法和差速贴壁法获取大鼠腰4-5 节段多裂肌MSCs。具体多裂肌MSCs 分离、培养、纯化方法参照已发表文章[14]。

1.3.5 MSCs的鉴定

取第4 代MSCs，以2×104个/孔细胞数接种于6 孔板，待细胞贴壁后，培养24 h 检测Pax7 的表达，培养72 h检测MyoD的表达。细胞经PBS清洗3次×5 min，4%多聚甲醛固定30 min，PBS 清洗3 次× 5 min；0.5%Triton X-100 破膜10min，PBS 清洗3 次× 5 min；5%山羊血清封闭1 h，PBS 清洗3 次× 5 min；加1∶100 稀释的一抗，4℃过夜；吸出一抗，PBS 清洗3 次×5 min，加入1∶100 稀释的FITC 标记的山羊抗兔/小鼠IgG，37℃避光孵育1 h，PBS 清洗3 次×5 min；加入1∶1000 稀释的DAPI 染核5 min；PBS 清洗1 次，荧光显微镜下观察染色情况并拍照。细胞鉴定过程重复3次。

1.3.6 指标检测

CCK-8（Cell Counting kit-8）检 测 各 组 血 清 对MSCs 增殖的影响：将细胞稀释成2×105个/mL，以2×104个/孔细胞悬液接种到96 孔板中。随机分为空白组、正常血清组、模型血清组、电针血清组，每组重复6孔。培养24 h后，空白组加入DMEM培养基，25 μl/孔；其余各组分别加入对应的正常血清、模型血清、电针血清，25 μl/孔。培养24 h后，加入CCK-8溶液，10 μl/孔。培养1 h 后，酶标仪（450 nm 波长）测定各孔平均吸光度（OD）值。CCK-8实验重复3次。

WB 检测Collagen I、MMP2 蛋白表达：①将细胞稀释成2×105个/mL，以1×106/皿接种细胞，随机分为正常血清组、模型血清组、电针血清组，培养24 h；②弃培养基，加入无血清DMEM 培养基同步化处理24 h；③弃培养基，每皿对应加入含相应血清的培养基，培养24 h；④提取总蛋白并测定蛋白浓度，蛋白变性后，以50 μg/孔蛋白上样。

WB 操作步骤同已发表文章所述[15]。以GAPDH作为内参对照，计算每个样本的Collagen I、MMP2 与GAPDH的光密度比值(IDV)。

1.3.7 统计学方法

应用SPSS 20.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差（x±s）表示。服从正态分布，方差齐，组间采用单因素方差分析（one-Way ANONA），两两比较用LSD-t 检验，不服从正态分布用非参数检验。P＜0.05为差异有统计学意义，P＜0.01为有显著性差异。

2 结果与分析

表1 各组血清对MSCs增殖的影响(±s)

表1 各组血清对MSCs增殖的影响(±s)

分组空白组正常血清组模型血清组电针血清组N 6666 OD值0.258±0.0031.659±0.113*1.821±0.074*※2.303±0.201*※※▲

2.1 MSCs形态特征及免疫荧光染色鉴定

由图2 可知，分离培养2d 的细胞呈折光性较强的球形，但贴壁数量少；随着时间培养时间的推移，贴壁细胞的数量明显增多，由圆形转变为梭型或纺锤形。由图3 免疫荧光染色结果可知，Pax7、MyoD 在细胞增殖过程中呈胞核表达阳性。具体见图2、图3。

图3 MSCs不同时期Pax7、MyoD免疫荧光染色观察

2.2 CCK-8检测各组血清对MSCs增殖的影响

与空白组比较，正常血清组模型血清组、电针血清组OD 值明显增加（P＜0.01、P＜0.01、P＜0.01）；与正常血清组比较，模型血清组、电针血清组OD 值升高（P＜0.05、P＜0.01）；与模型血清组比较，电针血清组OD值升高（P＜0.01）。见表1、图4。

2.3 电针血清对Collagen I、MMP2蛋白的表达的影响

与正常血清组比较，模型血清组Collagen I、MMP2蛋白表达升高（P＜0.01、P＜0.05），电针血清组Collagen I、MMP2 蛋白表达升高（P＜0.01、P＜0.01）；与模型血清组比较，电针血清组Collagen I蛋白表达降低（P＜0.01）、MMP2 蛋白表达升高（P＜0.01）。见表2、图5、附图1。

3 讨论

针刺作为腰痛行之有效的治疗方法，在世界范围内被广泛应用和认可[16-17],这可能与针刺改善局部微循环，提高自由基活性，调节相关细胞因子分泌有关。多裂肌与腰痛发生、发展和复发密切相关，但却很少受关注。本课题组前期研究发现，针刺可显著改善腰多裂肌损伤大鼠IGF1R、ERK、PI3K/Akt/mTOR 等多种细胞因子和信号通路的表达[18-20]。由于难以克服在体实验多因素的影响，其具体机制尚不十分明确，因此本实验采用电针血清作为干预手段，观察大鼠腰多裂肌MSCs增殖情况及ECM中Collagen I、MMP2表达量的变化，从血清学角度探究针刺治疗腰痛的部分作用机制。

图4 CCK-8检测各组血清对MSCs增殖的影响

表2 各组血清对MSCs中Collagen I、MMP2蛋白表达的影响(±s)(单位：光密度比值)

表2 各组血清对MSCs中Collagen I、MMP2蛋白表达的影响(±s)(单位：光密度比值)

分组正常血清组模型血清组电针血清组Collagen I 0.223±0.0220.356±0.023**0.261±0.007**※MMP20.566±0.0370.613±0.014*0.738±0.043**※

图5 WB检测各组MSCs中Collagen I、MMP2蛋白表达水平

附图1 各组Collagen I、MMP2蛋白表达条带图

MSCs 和邻近其他细胞共同参与完成骨骼肌损伤后的再生修复[21-22]，其中ECM 为MSCs提供结构支架和信号传递，通过信号传导系统直接影响MSCs 的激活、增殖、分化，调控骨骼肌重塑功能的正常发挥。由此可见，ECM 可能对损伤多裂肌的再生修复发挥重要作用。目前，针刺治疗骨骼肌损伤的研究集中于观察MSCs的自身变化，而忽视了ECM 对MSCs影响的重要性。因此，本研究着重从血清学角度观察电针后，血清干预对多裂肌MSCs增殖及ECM相关成分的影响。

ECM 是由Collagen、层粘连蛋白和蛋白聚糖等大分子物质组成的动态网状结构，表现为ECM 的沉积、重构和降解等[23-24]。其中Collagen I的沉积是导致骨骼肌纤维化的主要原因[25]，也是形成胶原纤维并发挥作用的前提条件[26]。有研究发现，针刺可能通过抑制Collagen I 的含量减轻纤维化程度[27]。通过透射电镜发现，针刺可以减轻损伤骨骼肌中胶原纤维的沉积和增生程度[28-29]。本研究发现由于电针后血清的干预，ECM 中Collagen I 含量下降；CCK-8 结果表明MSCs 增殖能力提高，表明针刺可能通过抑制Collagen I的表达促进MSCs的增殖。

MMPs（Matrix Metalloproteinases,MMPs）可以降解ECM 中胶原的沉积，与骨骼肌再生、肌纤维增殖和ECM 重建关系密切[30-31]。骨骼肌再生修复过程中MMP2 含量增加[32-33]。MMP2 含量的增加、Collagen I 的减少可能是肝纤维化程度减轻的原因[34-35]。本研究发现，电针后血清干预使MMP2 含量增加，Collagen I 表达下降，这可能是腰多裂肌MSCs 增殖的原因。由此可知，电针“委中”穴可能通过调节ECM 中与骨骼肌纤维化有关的Collagen I、MMP2 的蛋白表达，加快MSCs的增殖速度，促进损伤多裂肌的再生修复，但电针“委中”穴是通过血清中的哪些成份发挥对多裂肌再生修复的良性调节作用，仍需进一步的深入研究，这可能是揭示电针促进骨骼肌再生修复机制的关键所在。