HPLC-MS/MS法同时测定首荟通便胶囊中8种成份分析

彭艳 陶箭飞

摘要  目的：研究高效液相色譜-串联质谱（HPLC-MS/MS）法同时测定首荟通便胶囊中8种成份的作用。方法：采用HPLC-MS/MS法同时对首荟通便胶囊中8种成份进行分析，采用Agilent ZORBAX C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），将乙腈（A）-10 mmol/L乙酸铵溶液（B）作为流动相。梯度洗脱（0～1.2 min，5%A;1.2～2 min，5%A→20%A;2～4 min，20%A→40%A;4～8 min，40%A;8～10 min，40%A→95%A;10～17 min，95%A;17～25 min，5%A），设置流速为0.8 mL/min，进样量为5 μL。以电喷雾离子源，通过SIM模式，正负离子同时监测方式。结果：何首乌中大黄素、芦荟中芦荟大黄素、决明子中橙黄决明素、枸杞子中枸杞多糖、阿胶中强脯氨酸、人参中人参皂苷、白术中苍术酮、枳实中橙皮苷的线性范围分别为0.04～2.50 μg/mL（r=0.999 8）、0.034～0.998 0 μg/mL（r=0.999 6）、0.14～20 μg/mL（r=0.999 4）、0.04～20 μg/mL（r=0.999 9）、0.004～2 μg/mL（r=0.999 9）、0.05～2 μg/mL（r=0.999 6）、0.034～2.5 μg/mL（r=0.999 3）、0.007～0.2 μg/mL（r=0.999 5）。本方式的精密度、稳定性及重复性试验的RSD<3%，且平均回收率在97.3～102.7%范围内，RSD均<3%。3种样品中大黄素、芦荟大黄素、橙黄决明素、枸杞多糖、强脯氨酸、人参皂苷、苍术酮、橙皮苷的含量分别为0.491～0.499、1.790～1.802、0.506～0.512、0.681～0.684、0.610～0.614、0.102～0.110、0.056～0.058、0.020～0.022 mg/g。结论：HPLC-MS/MS法可为首荟通便胶囊的质量控制提供指导作用，值得临床推广应用。

关键词  首荟通便胶囊;高效液相色谱-串联质谱;多成分含量测定;何首乌;芦荟

Hplc-Ms/Ms Method Used for Simultaneous Determination of 8 Components in Shouhui Tongbian Capsule

PENG Yan1， TAO Jianfei2

（1 School of Pharmacy， Nanjing Medical University， Nanjing 211166， China; 2 Department of Pharmacy， Shanghai Yangsi Hospital， Shanghai 200126， China）

Abstract Objective： To study the simultaneous determination of 8 components in Shouhui tongbian Capsule by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （HPLC-MS/MS）.  Methods： A total of 8 components in the Shouhui Tongbian Capsule were analyzed by HPLC-MS/MS method. Agilent ZORBAX C18 column （250 mm×4.6 mm， 5 microns） was used. Acetonitrile （A）-10 mmol/L ammonium acetate solution （B） was used as the mobile phase. Gradient elution （0～1.2 min， 5%A; 1.2～2 min， 5%A→20%A; 2～4 min， 20%A→40%A; 4～8 min， 40%A; 8 min to 10 min， 40%A→95%A; 10～17 min， 95%A; 17～25 min， 5%A）. The flow rate was set as 0.8 mL/min， and the sample volume was 5 mul. To electrospray ion source， through SIM mode， positive and negative ions were simultaneously monitored.  Results： Emodin in Radix Polygoni Multiflori， aloe-emodin in Aloe vera L. var， aurantio-obtusin in Semen Cassiae （semen cassiae torae，lycium barbarum polysaccharide in Fructus Lycii the fruit of Chinese wolfberry，strong proline in Colla Corii Asini donkey-hide gelatin， ginsenoside in Radix Ginseng，atractylone in Rhizoma Atractylodis Macrocephalae bighead atractylodes rhizome， and hesperidin in Fructus Aurantii Immaturus were 0.04～2.50 μg/mL （r=0.999 8）， 0.034～0.998 μg/mL（r=0.999 6）， 0.014～20 μg/mL （r=0.999 4）， 0.04～20 μg/mL（r=0.999 9）， 0.05～2 μg/mL （r=0.999 6）， 0.034～2.5 μg/mL （r=0.999 3）， respectively ， 0.007～0.2 μg/mL （r=0.999 5）. The RSD of precision， stability and repeatability test of this method was less than 3%， and the average recovery was within the range of 97.3～102.7%， and the RSD was all less than 3%. The contents of emodin， aloe-emodin， aurantio-obtusin，lycium barbarum polysaccharide，strong proline， ginsenoside，atractylone， and hesperidin were 0.491～0.499， 1.790～1.802， 0.506～0.512， 0.681～0.684， 0.610～0.614， 0.102～0.110， 0.056～0.058， 0.020～0.022 mg/g， respectively.  Conclusion： HPLC-MS/MS method can provide guidance for the quality control of Shouhui tongbian Capsule and is worthy of clinical application.

Keywords  Shouhui Tongbian Capsule; High performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; Multicomponent content determination;Radix Polygoni Multiflori;Aloe vera L. var

中图分类号：R917 文献标识码：A  doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2020.14.006

首薈通便胶囊主要成分囊括何首乌、芦荟、决明子、枸杞子、阿胶、人参、白术、枳实8种，属于通便排毒以及减肥降脂的国家专利组方之一[1-2]。该药应用于功能性便秘的治疗效果显著，中医辨证为气阴两虚兼毒邪内蕴证者，症见便秘，腹胀，口燥咽干，神疲乏力，五心烦热，舌质红嫩或淡，舌苔白或白腻，脉沉细或滑数。具有泻浊通便、养阴益气的功效，有效促进患者胃肠功能的改善[3-4]。方中的何首乌以及芦荟当属君药，具有润肠通便、清肝泻热以及益精养血的功效;决明子与枸杞子以及阿胶均为臣药，具有滋补肝肾、清肝明目、滋阴润燥通便、补血止血的功效;人参与白术则为佐药，具有补气健脾的功效，且可促使泻不伤正;并以枳实破气消积，引经入药[5-6]。共奏养阴益气，补泻兼施，标本兼治之功。此外现代药理研究证实，芦荟提取物可通过对钠离子的主动转运产生一定程度的影响，进一步影响机体肠道内的水分分泌以及吸收平衡，从而发挥润肠通便的效果[7-8]。与此同时，组方中的其他相关中药对于便秘亦有不同的药理作用，如方中的人参、阿胶以及何首乌在滋补机体的基础上，有效提高机体免疫力，从而为病情的恢复创造有利条件[9-10]。众所周知，中药的临床治疗效果在一定程度上取决于有效成分含量的高低，因此如何有效对中药有效成分进行准确的测定显得尤为重要，亦是保障临床治疗效果的有效途径之一。鉴于此，本文通过研究高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）同时测定首荟通便胶囊中8种成份的含量，旨在为首荟通便胶囊的质量控制提供行之有效的方案，现报道如下。

1 仪器与药品

1.1 仪器 LC-20AT型高效液相色谱仪，LC-2020型质谱仪，LC solution色谱工作站（均购自岛津公司）。Agilent ZORBAX C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm;填料为十八烷基硅烷键合硅胶;购自安捷伦公司）。Sartorius BP 211D型电子天平（购自Sartorius公司，精确度为0.000 01）。CQ250L-DST型超声波清洗机（购自上海跃进医用光学器械厂）。TGL-21M型高速冷冻离心机（购自湖南湘仪实验仪器开发有限公司）。

1.2 药品及试剂 首荟通便胶囊（顺益舒，鲁南厚普制药有限公司，国药准字Z2015210041），对照品何首乌、芦荟、决明子、枸杞子、阿胶、人参、白术、枳实均购自中国食品药品检定研究院，有效成分含量均>98%。乙腈为色谱纯，水采用超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法及结果

2.1 色谱条件 采用Agilent ZORBAX C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），将乙腈（A）-10 mmol/L乙酸铵溶液（B）作为流动相。梯度洗脱（0～1.2 min，5%A;1.2～2 min，5%A→20%A;2～4 min，20%A→40%A;4～8 min，40%A;8～10 min，40%A→95%A;10～17 min，95%A;17～25 min，5%A），设置流速为0.8 mL/min，进样量为5 μL。

2.2 质谱条件 使用仪器为电喷雾离子化源，电压设置为3.5 kV，雾化器压力241 kPa。以氮气作为干燥气，流速设置为1.5 L/min。离子喷雾温度设置为350 ℃。正负离子方式同时监测，将选择离子检测作为扫描方式。

2.3 相关溶液制备

2.3.1 对照品储备液制备 分别取适量何首乌、芦荟、决明子、枸杞子、阿胶、人参、白术、枳实对照品，实施精密称定，加入甲醇制备为含何首乌10 μg/mL、芦荟2 μg/mL、决明子20 μg/mL、枸杞子10 μg/mL、阿胶2 μg/mL、人参20 μg/mL、白术20 μg/mL、枳实2 μg/mL单一成分溶液。（其中何首乌中大黄素含量0.184 mg/g，芦荟中芦荟大黄素含量为0.03 μmol/g，决明子中橙黄决明素含量为1.20%，枸杞子中枸杞多糖含量为0.35 g/g，阿胶中强脯氨酸的含量为10.20%，人参中人参皂苷含量>98%，白术中苍术酮含量为43.7%，枳实中橙皮苷的含量为12.00%）。

2.3.2 供试品溶液 精密称取样品粉末0.1 g，放置在50 mL离心管内，加入40 mL的甲醇，超声（250 W，40 kHz）30 min，置于室温条件下混匀，过滤，并精密吸取4 mL续滤液在5 mL量瓶内，加入甲醛定容，混匀后采用0.45 μm微孔滤膜滤过，采集续滤液。

2.3.3 阴性样品溶液 根据首荟通便胶囊处方比例与制备工艺制备不含何首乌、芦荟、决明子、枸杞子、阿胶、人参、白术、枳实的阴性样品，并根据2.3.2的方式获取阴性样品溶液。

2.3.4 专属性试验 取混合对照品溶液，供试品溶液以及阴性样品溶液各5 μL，于上述色谱质谱条件下完成测定。结果样品色谱图和对照品色谱图一致的保留时间处存在相应的色谱峰。而阴性样品色谱图中无相应色谱峰，说明了样品测定无干扰。

2.3.5 线性关系考察与检测限、定量限测定 精密吸取对照品储备液以及适量的内标溶液，加入甲醇逐步稀释，制备各待测物质量浓度为0.003～20 μg/mL的7个不同浓度混合对照品溶液，根据上述色谱-质谱条件测量峰面积。此外将待测物质峰面积和内标峰面积的比值作为纵坐标（Y），各物质质量浓度作为横坐标（X），从而绘制标准曲线，同时完成线性回归计算，获取相应的标准曲线回归方程。结果发现不同成分于相应的线性范围内存在良好的线性关系。结果见表1所示。大黄素、芦荟大黄素、橙黄决明素、枸杞多糖、强脯氨酸、人参皂苷、苍术酮、橙皮苷的线性范围分别为0.04～2.50 μg/mL（r=0.999 8）、0.034～0.998 0 μg/mL（r=0.999 6）、0.14～20 μg/mL（r=0.999 4）、0.04～20 μg/mL（r=0.999 9）、0.004～2 μg/mL（r=0.999 9）、0.05～2 μg/mL（r=0.999 6）、0.034～2.5 μg/mL（r=0.999 3）、0.007～0.2 μg/mL（r=0.999 5）。

2.3.6 精密度实验 精密吸取上述2.3.5的混合对照品溶液，根据上述色谱条件进行连续6次的进样，测定峰面积并计算RSD。结果显示大黄素、芦荟大黄素、橙黄决明素、枸杞多糖、强脯氨酸、人参皂苷、苍术酮、橙皮苷的RSD分别为1.2%、1.5%、1.7%、2.1%、1.6%、1.9%、1.4%、2.0%，说明该仪器的精密度较为理想。

2.3.7 稳定性实验 取供试品溶液分别在0、2、4、6、8及24 h进样检测，计算峰面积。结果显示：大黄素、芦荟大黄素、橙黄决明素、枸杞多糖、强脯氨酸、人参皂苷、苍术酮、橙皮苷峰面积的RSD分别为1.5%、2.3%、1.7%、1.3%、1.9%、1.7%、2.0%、1.8%，表示供试品溶液于24 h内稳定性较佳。

2.3.8 重复性试验 取同批样品6分，分别根据上述方式制备供试品溶液，并予以测定，剂量峰面积，计算样品含量。结果显示：大黄素、芦荟大黄素、橙黄决明素、枸杞多糖、强脯氨酸、人参皂苷、苍术酮、橙皮苷的平均含量分别为492.3、1 809.4、507.3、679.3、614、109、57及22 μg/g，RSD分别为1.0%、1.5%、1.5%、1.8%、1.4%、1.4%、2.0%、1.6%、说明该方式的重复性良好。

2.3.9 加样回收率试验 取已知含量的样品0.05 g，精密称取后分别加入混合对照品溶液适量，根据上述方式完成供试溶液的制备，予以進样测定，并完成回收率的计算。见表2。

2.3.10 样品测定 分别取3批样品，根据上述方式制备供试品溶液完成测定，参照内标法计算样品中不同成分含量。3种样品中大黄素、芦荟大黄素、橙黄决明素、枸杞多糖、强脯氨酸、人参皂苷、苍术酮、橙皮苷的含量分别为0.491～0.499、1.790～1.802、0.506～0.512、0.681～0.684、0.610～0.614、0.102～0.110、0.056～0.058、0.020～0.022 mg/g。见表3。

3 讨论

HPLC-MS/MS具有较高的专属性以及灵敏度，可于较短的时间内同时对多种药物成分进行有效的分离，同时完成准确的定量分析，继而可有效提高检测效率[11-13]。目前该方法已被广泛应用于如枫蓼肠胃康合剂、健脾益肾丸等中药制剂的有效成分分析中，且效果较为明显。既往，临床上尚无关于首荟通便胶囊8种成分含量分析的研究报道。其中HPLC-MS/MS不仅具有较好的选择性以及灵敏度，同时不要求被测的成分完全分离，这极其有利于分析相对复杂的重要复方制剂[14-16]，因此本文选用HPLC-MS/MS法对首荟通便胶囊的8种有效成分含量实施同时测定。与此同时，HPLC-MS/MS法在测定的过程中采用内标法，这可有效提高测定的精密度以及准确度。相较于多反应监测模式，HPLC-MS/MS法所采用的SIM模式专属性较低，从而会促使样品选择离子流图中部分测定成分出现多个色谱峰。而本文通过紫外检测器定位测定成分色谱峰的保留时间，从而在一定程度上弥补了上述不足[17-18]。

在对各项被测成分的质谱参数实施优化的过程中发现，大黄素于正离子检测模式下的相应相对较好，且易产生加合离子峰。其他7个有效成分则在负离子模式下的相应显著高于正离子模式，于负离子检测模式下易产生加合离子峰，因此本文确定选择正负离子模式对首荟通便胶囊的8个成分进行同时检测。本研究通过考察乙腈-水、乙腈-乙酸铵水溶液、乙腈-甲酸水溶液等流动相体系，结果发现，以乙腈-乙酸铵水溶液为流动相时，样品内的各成分色谱峰分离较佳，且有效提高其检测灵敏度。因此本方法最终采用乙腈-10 mmol/L乙酸铵水溶液作为流动相。此外在提取方法的选择过程中发现，超声以及回流提取的效果并无明显差异，因此选用了较为渐变的超声提取方式[19-20]。另外在考察可不同提取溶剂后，结果发现甲醇的提取率最高，因此将其作为提取溶剂。

综上所述，HPLC-MS/MS法同时检测首荟通便胶囊8种成分含量中具有快速、准确、高效以及灵敏的优势，可作为测定首荟通便胶囊内在化学指标成分含量的有效手段之一。

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（2019-11-14收稿 责任编辑：王杨）

基金项目：国家自然科学基金面上项目（30300435）

作者简介：彭艳（1984.10—），女，硕士，实验师，研究方向：药物分析，E-mail：462662398@qq.com

通信作者：陶箭飞（1967.10—），女，硕士，主任药师，研究方向：临床药学，E-mail：lyptjfll@163.com