富血小板血浆联合强骨胶囊对大鼠骨质疏松性骨折骨愈合的影响

黄 星 欧锐金 李国兴

广东省罗定市人民医院骨科(罗定 527200)

骨质疏松是临床常见的骨科疾病，在临床主要表现为骨量以及骨密度的显著性下降，在骨质疏松患者的疾病进展过程中，骨折是较为常见的并发症之一[1]，严重威胁患者的生命质量。生理学研究发现[2]，在对骨质疏松患者的疾病进展中，破骨细胞发挥主导作用。而在骨折患者的重建过程中，由于病灶部位的骨折的重建速度过快，造成患者骨痂力度形成的强度不足[3]。在临床对患者的治疗过程中，富血小板血浆通过对多种炎性因子的释放作用，促进患者的细胞增殖、分化以及血管的形成，对于患者的预后具有积极的意义[4]。强骨胶囊的主要成分为骨碎补，通过对患者的骨量的增加，对于患者骨痂的愈合具有积极的意义[5]。本研究通过对富血小板血浆联合强骨胶囊对大鼠骨质疏松性骨折骨愈合的影响分析，为临床治疗提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂和材料

80只未交配、3月龄雌性健康SD大鼠，所有大鼠平均体质量为(202.45±2.12)g，室温控制在(21±2)℃，湿度30%～70%，光照每昼夜12 h。将以上大鼠分为空白组(K组)、 PRP组(P组)、强骨胶囊组(Q组)，联合组(L组)，每组大鼠20例，实验全程严格按照国家有关实验动物的规定执行，经医院生物医学研究伦理委员中心批准。

1.2 研究方法

对所有的实验大鼠腹腔注射戊巴比妥麻醉后，皮肤消毒，暴露两侧卵巢及输卵管，结扎输卵管后切除双侧输卵管，缝合伤口，连续3日每日肌注青霉素。3月后骨质疏松模型建立。

大鼠自体富血小板血浆制备，与骨质疏松性骨折模型前一天，眼眶采血采集P组及L组静脉血2 mL，将血液介入含有枸橼酸钠溶液的离心管中，颠倒使其充分混匀，将大鼠做好标记。采用二次离心法中的landsbergs法，制备PRP；①先予3 659转/min的速率离心10 min，取血浆层及两层交界面下2 mm的液体放置于另外一新的离心管中，②以3000转/min的速率离心10 min，液体分为两侧，取剩下的1/4层即为PRP，将制备好PRP加入凝血酶激活剂，摇匀，PRP凝胶状后置入- 20 ℃冰箱备用。

建立骨质疏松性骨折内固定大鼠模型。腹腔注射戊巴比妥麻醉后，取左后肢剃毛皮肤消毒，无菌条件下于胫骨前面上1/3中心作长约1.5 cm纵行切口，钝性分离组织，锯断胫骨，骨折端复位后予医用无菌1.0克氏针穿髓腔固定骨折端，并将克氏针尾端作折弯处理；同时P组及L组大鼠骨折端保持无菌环境注入制备好的PRP；缝合皮下组织及皮肤，术后每次大鼠每日肌注青霉素10万U两侧，连续3天。

联合用药组大鼠：强骨胶囊(骨碎补总黄酮)为北京岐黄药业提供，每克药中含骨碎补总黄酮含量为0.66 g，每粒药重2.5 g，使用时加蒸馏水配制成固定的浓度(剂量0.108·kg-1·d-1)，用大鼠灌胃针灌胃。

1.3 观察指标

1.3.1 四组大鼠骨痂显微形态比较。分别对四组大鼠的胫骨进行采集标本，使用显微CT对实验大鼠标本的进行断层扫描以及三维重建，对实验大鼠的骨痂形态进行分析。骨痂的形态主要包括骨小梁体积、数量、厚度、分离度、连接密度以及表面积体积比之间的差异。

1.3.2 四组患者的生物力学指标比较。于骨质疏松性骨折造模术后6周，每组各取5只大鼠，麻醉后行X线检查，检查后脱颈处死，剃毛，消毒，于原切口瘢痕出取出胫骨，剥离组织，随机将其浸泡于10%福尔马林溶液(pH=7.4)中固定72 h，72 h后将标本予磷酸缓冲盐溶液浸泡冲洗15 min，重复3次；之后放入装有75%酒精的标本被中，并置于4 ℃冰箱中保持备用，予同样方法取对侧整根胫骨，由生理盐水浸湿后的湿纱布包裹放入- 20 ℃冰箱中备用，复温后进行生物力学测试。对大鼠胫骨进行压缩试验，将标本从- 20 ℃取出，复温，放置于生物力学试验机上进行压缩试验，加载速度设定为2 mm/min，先予加载10N三次，3次完全卸载后再观察是否归零。每个标本进行3次。最后给予加载100N一次，观察最大载荷，记录结构最大载荷、结构能量吸收、材料最大应力、材料能量吸收。

1.3.3 四组大鼠的组织形态学比较。用于病理组织学检查的手术侧胫骨标本，经脱钙6周后，将标本脱水处理，脱水后予石蜡包埋制成蜡块标本，转轮式切片以厚度为4 μm为准，连续切片，30 ℃烤片过夜，备用。取切片后的骨组织，行HE染色，于显微镜下比较切片内骨架面积(mm2)及软骨或骨性骨痂面积比。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，所有计量资料采用独立样本t检验进行对比。两两比较，采用LSD-t检验，计量资料以[n(%)]，P<0.05说明差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 四组大鼠骨痂显微形态比较

四组大鼠的骨小梁体积、数量、厚度、分离度、连接密度以及表面积体积比之间的差异存在统计学意义(P<0.05)，经过两两比较，联合用药组患者的骨小梁体积、数量、厚度、连接密度高于单独用药组，分离度、表面积体积比低于对照组(P<0.05)。见表1。

表1 四组大鼠骨痂显微形态比较 n=20

2.2 四组患者的生物力学指标比较

四组大鼠的结构最大载荷、结构能量吸收、材料最大应力、材料能量吸收之间的差异存在统计学意义，联合用药组患者的最大载荷、结构能量吸收、材料最大应力、材料能量吸收高于单独用药组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 四组患者的生物力学指标比较 n=20

2.3 四组大鼠的组织形态学比较

四组患者的骨架面积及软骨或骨性骨痂面积比之间的差异存在统计学意义(P<0.05)，经过两两比较，联合用药组患者的骨架面积及软骨或骨性骨痂面积比高于单独用药组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3、图1。

表3 四组大鼠的组织形态学比较 n=20

图1 A为对照组，B为联合治疗组

3 讨 论

随着年龄的增长，患者的骨质疏松发病率显著升高，有研究认为[6]，随着患者骨组织的不断衰老，其钙盐以及基质的比例显著发生变化，骨质疏松患者多见于绝经后的女性以及老年男性。在骨质疏松骨折患者中，多见于退行性骨质疏松，患者表现为显著的身长缩短以及驼背[7]。在对骨质疏松患者的血清学指标的分析中，其血清钙、磷含量通常处于正常水平，骨折患者在痊愈后可表现为碱性磷酸酶水平的异常增高[8]。富含血小板的血浆可通过对患者的多种细胞因子的释放，改善患者的细胞愈合、增殖，对于患者的骨折部位的愈合具有积极的意义。强骨胶囊的主要成分为骨碎补总黄酮，该种成分对于患者的骨骼新陈代谢水平具有重要意义[9]。

本研究中采用的动物模型为女性绝经后的骨质疏松，在对实验大鼠直视的情况下，对实验大鼠进行骨折模型的制备。研究认为[10]，在实验大鼠的骨折后，骨折病灶部位的修复过程中，在软骨细胞的形成以及成熟过程中，通过软骨细胞的肥大作用，其基质发生溶解钙化，同时，新生的血管通过对软骨内组织的浸润，进一步促进成骨细胞的形成，最终促进患者的骨痂愈合[11]。在此过程中，随着对实验大鼠的富含血小板的血浆使用，通过对实验大鼠多种细胞因子的分泌，促进成骨细胞以及软骨细胞的增殖，对于患者的骨痂愈合具有重要的意义[12]。而在对实验大鼠采用强骨胶囊治疗，通过对实验大鼠的骨质新陈代谢水平的升高，对于骨折的预后具有积极的作用[13]。在本研究中，联合用药组患者的骨小梁体积、数量、厚度、连接密度显著高于单独用药组，分离度、表面积体积比显著低于对照组；联合用药组患者的最大载荷、结构能量吸收、材料最大应力、材料能量吸收显著高于单独用药组；联合用药组患者的骨架面积及软骨或骨性骨痂面积比显著高于单独用药组，提示，通过联合用药，实验大鼠的骨质密度以及抗压性显著提升，同时通过对骨痂面积比例的分析，实验大鼠的骨痂面积显著降低，由此造成的局部炎性反应水平相对降低[14]。研究认为，在实验大鼠的病变过程中，由于实验大鼠处于高度应激反应过程中，由此造成的实验大鼠血管内皮细胞的损伤，局部炎性因子大量分泌，在一定程度上抑制了骨质的愈合[15]。而在实验大鼠的治疗中， 通过采取强骨胶囊以及富含血小板的血浆治疗中，通过联合治疗，共同发挥协同作用，治疗效果显著。

综上所述，富血小板血浆联合强骨胶囊通过对骨折部位骨质密度以及骨质强度的显著增强，大鼠骨质疏松性骨折骨愈合情况良好。