斑点叉尾鮰致病性类志贺邻单胞菌的分离鉴定及药物敏感性

吕小燕，袁汉文,何爱美，杨文秀，张哲华，郑楚文，李 骞，许巧情

(1.长江大学动物科学学院，湖北 荆州 434025；2.应城市农业技术推广中心，湖北 孝感 432400)

斑点叉尾鮰(IetalurusPunetaus)属鲶形目，鮰科，亦称沟鲶，其体形较长，无鳞，尾鳍分叉较深，背部浅灰色，腹部乳白色，体两侧有不规则浅黑色斑点[1]。斑点叉尾鮰原产于美国，上个世纪六十年代开始商业化成鱼养殖，被世界公认为最适合加工的优质淡水养殖品种之一[2]，然而养殖中细菌性疾病的发病率不断上升，造成斑点叉尾鮰大规模死亡，严重阻碍了斑点叉尾鮰产业的发展。斑点叉尾鮰病害常见有细菌性疾病、真菌性疾病、病毒性疾病等，而细菌性疾病中主要有肠道败血症、腐皮病、烂鳃病以及肠套叠病[3]。对斑点叉尾鮰细菌性病原进行分离鉴定，发现11个致死率高的菌株，其中4个菌株为叉尾鮰爱德华菌(Edwardsiellaictaluri)，4个菌株为嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)以及未能鉴定的另外3个菌株[4]。而对斑点叉尾鮰肠败血症病原分离发现两株G-短杆菌，经鉴定后为致病性叉尾鮰爱德华氏菌。刘礼辉等[5]从斑点叉尾鮰烂鳃中分离出一株(0.3～0.5)μm×(5～10)μm革兰氏阴性菌，经鉴定后为柱状黄杆菌(Flavobacteriumcolumnare)。关于对斑点叉尾鮰类志贺邻单胞菌(Plesiomonasshigelloides)的尚未见报道，本研究通过16S rRNA基因序列分析以及药敏试验对斑点叉尾鮰类志贺邻单胞菌进行分离鉴定，以期为斑点叉尾鮰细菌性疾病的研究提供基础理论依据和生产实践中的防治方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2019年5月斑点叉尾鮰病鱼取样于湖北荆州万乐源有限公司基地，体长42～50 cm，体重2～3 kg。牛肉膏蛋白胨肉汤培养基(LB)、诺氟沙星、多粘菌素B、头孢曲松、万古霉素、复方新诺明、氧氟沙星、四环素、多西环素、环丙沙星、丁胺卡纳等30种抗菌药物药敏纸片，购自杭州微生物有限公司；dNTP(2.5 mmol·L-1)、EasyTaq酶(5 U·μL-1)、10×EasyTaq Buffer(1.2 mL)，均购自北京全式金生物技术有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 细菌分离与培养 将斑点叉尾鮰进行体表消毒后解剖，从脾脏、肝脏、肠等处取样，接种于富含营养的培养基平板上，37 ℃恒温过夜培养12 h，挑选优势菌落，经纯化后转接至斜面培养基进行培养，观察平板上菌落形态，选择颜色不同、形态各异、大小不同的菌落，挑选单菌落，然后培养12 h，进行PCR检测，连接转化，分子凝胶成像检测后测序。

1.2.2 药敏实验 用Kirby-Bauer纸片扩散法检测药物敏感性，在无菌条件下将病原菌致密划线接种到普通平板，将各种药敏纸片紧贴于培养基上，37 ℃培养18～24 h，测定抑菌圈直径[6]。抑菌圈直径d>15 mm，为敏感(S)；抑菌圈直径10 mm

1.2.3 16S rDNA 序列的扩增与测序 PCR反应体系为25 μL：2.5 μL 10×PCR Buffer，2.5 μL d-NTP(10 mmol/L)，上、下游引物(F/R，10 μmol/L)各1 μL，0.25 μL r-Taq DNA聚合酶(5 U/μL)，2 μL DNA模板，dd H2O补足至25 μL。PCR反应条件为：95 ℃下预变性5 min，95 ℃下变性30 s，58 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸1 min 30 s，72 ℃下延伸10 min，共32个循环，最后在72 ℃下再延伸10 min。扩增产物经0.2 %琼脂糖凝胶电泳检测回收后，送武汉擎科生物技术有限公司测序。

1.2.4 PCR引物设计与合成 如表1所示。

表1 PCR扩增引物

2 结果与分析

2.1 斑点叉尾鮰发病主要特征

斑点叉尾鮰发病前期出现食欲减退，摄食减少，在水面盘旋游动，约半小时后，患病鱼浮出水面，对斑点叉尾鮰进行检验观察，发现体表有大量红点，鳍基部与吻部均有充血现象，体外表皮有黄色不明物质，肛门红肿，腹部鼓起。解剖观察发现，腹部有透明液体流出，肝脏颜色肿大，无光泽，肠道呈充血状(封三图1所示)。

2.2 16S rRNA基因序列测定与系统分析结果

PCR产物经武汉擎科生物公司测序后，用Blast软件对分离出的细菌进行16S rRNA序列比对，16S rRNA基因序列测定与系统发育树构建分析，结果表明，图2所示该菌株YZ1010与Plesiomonasshigelloidesstrain聚成一个分支，序列相似度为100%，亲缘关系最为相近，即判定该菌为类志贺邻单胞菌。

通过PCR检测，得到的片段长度约为1 500 bp，与目标的16S rRNA条带基本一致，电泳结果如图3所示。

2.3 类志贺邻单胞菌对药物的敏感性差异

由表2可知，通过采用30种不同药敏片进行检测，发现在一定药剂浓度范围内，药剂的浓度越高抑菌圈的直径越大。其中发现类志贺邻单胞菌对呋喃唑酮、头孢拉定、头孢曲松、头孢唑林、头孢呋辛5种药物高度敏感；对氧氟沙星、头孢氨苄、哌拉西林等11种药物中度敏感；对环丙沙星、复方新诺明、羧苄西林等14种药物不敏感。

表2 不同药敏片的抑菌效果差异性

2.4 回归感染实验

从-80 ℃将保存的分离菌株类志贺邻单胞菌进行复苏，于37 ℃培养4～6 h，将菌悬液浓度调节为1×101～1×106cfu/mL。取健康的斑点叉尾鮰，进行人工感染。实验组和对照组各准备20尾，每尾注射剂量为0.2 mL，对照组注射0.2 mL的PBS溶液(无菌的缓冲液)，实验组注射复苏的菌液，依次按照梯度进行注射，并且每天观察2～4次，详细记录斑点叉尾鮰生长情况。

人工感染实验中，实验组中注射类志贺邻单胞菌菌悬液后，浓度在1×101～1×106cfu/mL，死亡率呈现逐渐上升趋势，浓度越高，斑点叉尾鮰死亡率越高(见表3)。注射PBS的对照组无死亡现象，也无任何病症。人工感染后，菌株感染的斑点叉尾鮰，出现反应迟缓，不摄食，鳍基部均有充血，肛门红肿，感染的实验鱼体腔充满腹水，肝肿大，肠充血。感染后出现的症状与自然发病个体的症状基本相同。

表3 人工感染实验结果

3 讨论

近年来，伴随着鱼类养殖业不断发展，由于养殖密度增大、水质恶化、投喂方式不当等因素，各种细菌引起的疾病也逐渐爆发，其中在鱼类增养殖中类志贺邻单胞菌是引起水产动物发病死亡的常见致病菌。类志贺邻单胞菌为需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性短杆菌，在分子水平上与邻单胞菌(Plesiomonas)属和变形杆菌(Proteus)属更为接近，因此类志贺邻单胞菌划归到肠杆菌科，邻单胞菌属[7]。研究发现类志贺邻单胞菌感染草鱼(Ctenopharyngodonidellus)后导致其肌肉糜烂、肝脏有出血点、脾脏肿大、肛门红肿等[8]，感染金鱼(CarassiusauratusLinnaeus)、大鲵(Andriasdavidianus)、尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)、鲟鱼(Sturgeons)后也都会出现胆囊和脾脏肿大、采食量减少、肝脏点状出血等一系列病症[9-12]。而在本试验中患病斑点叉尾鮰也出现类似症状。在临床表现上类志贺邻单胞菌感染的患病鱼与常见的赤皮病、腐皮病相似，增加了诊断难度[13]。在回归感染中，健康斑点叉尾鮰随着注射类志贺邻单胞菌菌液浓度减少，死亡尾数降低，而人工感染后出现的症状也与自然发病个体的症状基本相同。而在草鱼、金鱼、大鲵、尼罗罗非鱼和鲟鉴定出的类志贺邻单胞菌虽有种属存在差异，但也表现出类似病症[8-12]。这可能是病原微生物感染时，打破了动物肠道菌群动态平衡，而不同品种鱼免疫机制存在差异，类志贺单胞菌感染导致鱼类肠道免疫系统发生变化，从而影响肠道系统免疫功能[14]。

通过以保守的16S rRNA基因序列为基准，找到序列差异鉴定种属，不依赖于微生物的分离培养，从而快速且准确鉴定微生物[15]。本试验中通过PCR检测，得到的片段长度约为1 500 bp，与目标的16S rRNA条带基本一致，并且在16S rRNA基因序列测定与系统分析结果进一步证实分离菌株为类志贺邻单胞菌。这与在类志贺邻单胞菌感染的黄颡鱼扩增得到的片段约为1 461 bp结果相似[16]。

目前环境污染和细菌耐药性是影响水产行业发展的重大问题。在患病黄颡鱼中分离的菌株类志贺邻单胞菌，药敏试验表明该菌对头孢哌酮、庆大霉素等敏感，对四环素中度敏感，对苯唑西林、氨苄西林等不敏感[16]。龙苏等发现类志贺邻单胞菌感染的黄颡鱼还对另外先锋VI、菌必治、舒普深等16种药物高度敏感，对青霉素G和氨苄青霉素都不敏感[17]。可见对于同一品种所感染的同一种病原株有多种防治药物，因此在选择的时候要具有针对性。在患病黄沙鳖幼鳖中分离出的类志贺邻单胞菌对菌必治、舒普深、氟哌酸、多粘菌素B和环丙沙星高度敏感，但对青霉素G、氨苄青霉素、苯唑青霉素等15种药物不敏感[18]。在患病杂交鲟中分离的类志贺邻单胞菌对氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、多环西素4种药物敏感，对卡那霉素、阿莫西林、泰乐菌素、复方新诺明4种药物耐药[19]。可见对于同一病原株在不同的养殖对象上，类志贺邻单胞菌对于药物的敏感性有所不同，这可能与病原来源、养殖环境、感染途径不同有关。因此对斑点叉尾鮰进行药物治疗时，应更具有针对性，从而做到科学合理用药，有效防控疾病。在斑点叉尾鮰病害研究上，类志贺邻单胞菌的致病机理、致病功能基因、免疫防控等仍是需要重点研究的课题。