HPLC法测定黑果腺肋花楸不同形态果实中的原花青素含量

胡祺鹏， 赵鹏宇， 安仁波， 金莉莉

( 延边大学 药学院， 吉林 延吉 133002 )

0 引言

黑果腺肋花楸(Aroniamelanocarpa)为蔷薇科腺肋花楸属多年生落叶灌木，果实为球形，果皮呈紫黑色，果肉呈暗红色.黑果腺肋花楸原产于北美洲东北部，目前在我国辽宁、吉林、黑龙江等地有引种栽培[1].研究表明，黑果腺肋花楸含有黄酮、花青素和原花青素、糖类、挥发油、维生素类、钙、铁等多种成分[2-4]，其中多酚类化合物(原花青素)具有抗氧化、降血糖、改善血液循环、保护心脏、抗肿瘤、减轻妇女经前综合征等功效[5-9]，因此黑果腺肋花楸具有良好的药食两用价值[10].

原花青素是一类以黄烷-3-醇为主要结构单元的缩合多酚类化合物，这些黄烷醇单元之间通常以4 → 8位或4 → 6位的碳―碳键连接，生成聚合度不同的复合体.研究表明，在食品中的原花青素中，二聚体的有8种、三聚体的有32种、四聚体的有128种、五聚体的有512种[11].目前，测定花青素的方法有紫外分光光度法、香草醛- 盐酸法、铁盐催化比色法、正丁醇- 盐酸法、高铁盐- 铁氰化钾比色法、高锰酸钾分光光度法、HPLC法等[12]；但由于原花青素的组成较为复杂，难以使用同一种方法测定其每一组分的含量，因此对于原花青素的测定方法至今未有统一的标准.HPLC法是一种灵敏、高效的色谱技术[13]，目前已有学者采用正丁醇- 盐酸- HPLC法、硫解- HPLC法等方法对原花青素的含量进行了测定，并取得了较好的结果[14-15].本文选用HPLC法测定黑果腺肋花楸新鲜果实、果实粉末和烘干果实中原花青素的含量，旨为开发利用黑果腺肋花楸提供参考.

1 实验仪器、材料与方法

1.1 实验仪器

WZ -180SP旋转蒸发器,上海申科技有限公司； Chromaster 5430二极管阵列检测器,郑州长城科工贸有限公司； MP200B电子天平,上海精科天平仪器厂； Chromaster 5310柱温箱,上海宝山顾村电光仪器厂； LC -10A日立高效液相色谱仪,日本岛津公司； FC - 203B pH调节计,德国赛多利斯科技有限公司； Chromaster 5210自动进样器,瑞士Bruker公司.

1.2 实验材料

原花青素标准品(UV≥95%)，上海如吉生物科技发展有限公司(CAS:4852-22-6)；黑果腺肋花楸果实，购于吉林省汪清县蓝莓基地，经延边大学药学院吕惠子教授鉴定为黑果腺肋花楸果实；黑果腺肋花楸烘干果实(新鲜果实在烘箱中60 ℃烘干制得)；黑果腺肋花楸果实粉末(新鲜果实自然风干粉碎后制得)；无水乙醇(分析纯)、柠檬酸(分析纯)，天津科密欧化学试剂有限公司；甲醇(色谱纯)，辽宁泉瑞试剂有限公司；超纯水，用超纯水机制备(吉林省新通州教仪有限公司).

1.3 实验方法

1.3.1浸膏的制备 将30 g新鲜的黑果腺肋花楸果实粉碎，使用经柠檬酸酸化的乙醇(体积分数为60%、pH=3)回流提取3次(提取温度60 ℃，提取时间1 h)；合并3次提取液后进行减压浓缩，获得浸膏10.4 g.使用同样的提取方法和提取条件对烘干果实及果实粉末进行提取，得到各浸膏9.2 g.

1.3.2对照品溶液的制备 在室温下称取原花青素对照品5.0 mg置于5 mL容量瓶中，加入甲醇定容至5 mL，得到1 mg/mL对照品溶液；吸取1 mg/mL对照品溶液5 mL置于10 mL容量瓶中，再加入经柠檬酸酸化的超纯水(pH=3)定容至10 mL，得到0.5 mg/mL对照品溶液.按上述方法依次配制0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 mg/mL对照品溶液.

1.3.3供试品溶液的制备 在室温下称取各浸膏0.02 g，分别置于1 mL容量瓶中，加入经柠檬酸酸化的超纯水(pH=3)定容至1 mL，得到20 mg/mL 供试品溶液.根据对照样品溶液中的原花青素含量确定稀释倍数.

1.3.4HPLC条件选择 经过预实验确定HPLC的最佳条件，即：流动相中水和甲醇的体积比为75∶25，柱温为40 ℃，检测波长为280 nm，进样量为10 μL，流速为1 mL/min.

1.3.5线性关系考察 取对照品溶液10 μL，按1.3.4确定的色谱条件进样分析，并测定其峰面积，然后以浓度(x)为横坐标、峰面积(y)为纵坐标进行线性回归分析.

1.3.6重复性实验 取供试品溶液，按1.3.4所确定的最佳色谱条件连续进样6次(每次10 μL)，并测定进样中原花青素的峰面积和保留时间，计算RSD值.

1.3.7精密度实验 取系列对照品溶液，按1.3.4 所确定的最佳色谱条件连续进样6次(每次10 μL)，并测定进样中原花青素的峰面积和保留时间，计算RSD值.

1.3.8稳定性实验 取供试品溶液，按1.3.4 所确定的最佳色谱条件以0、2、4、8、12、24 h为间隔时间连续进样6次(每次10 μL)，并测定进样中原花青素的峰面积和保留时间，计算RSD值.

1.3.9加样回收率实验 取供试品溶液6份，分别加入对照品溶液1 mL，然后按1.3.4 所确定的最佳色谱条件进样，并计算进样中原花青素的平均加样回收率和RSD值.

2 实验结果与分析

2.1 原花青素的测定结果

原花青素的测定结果见图1.由图1可知，对照品和供试品溶液中的各成分分离状况良好.以浓度(x)为横坐标、峰面积(y)为纵坐标进行线性回归，得到原花青素的回归方程：y=23 470x+241.12，R2=0.998 9 (n=6)， 如图2所示.由图2可以看出，进样量在0.06～1.1 μg/mL范围内与峰面积呈线性关系.

按1.3.4确定的色谱条件对各批样品进行测定并计算原花青素的含量，结果见表1.

2.2 方法学考察结果

2.2.1重复性考察 取同一批新鲜黑果腺肋花楸果实浸膏0.02 g，平行6份(精密称定)；按1.3.3方法制备供试品溶液，分别进行进样测定.测定结果显示，原花青素峰面积的RSD值为0.78%(<1%)，该结果表明方法的重复性良好.

2.2.2精密度考察 取对照品溶液，按1.3.4色谱条件连续进样6次，以此考察各峰的相对保留时间及相对峰面积的一致性.结果显示，原花青素峰面积的RSD值为0.99%(<1%),表明测定原花青素含量的仪器其精密度良好.

2.2.3稳定性考察 取新鲜黑果腺肋花楸果实浸膏0.02 g，按1.3.3方法制备供试品溶液，按1.3.4 确定的色谱条件分别进样0、2、4、8、12、24 h.结果显示，原花青素相对峰面积的RSD值为0.85%(<1%)，该结果表明供试品溶液中的原花青素成分在24 h内稳定.

2.2.4加样回收率考察 取新鲜黑果腺肋花楸果实浸膏0.02 g，平行6份(精密称定)；在浸膏中分别加入对照品溶液(按供试品中已知量的80%、100%、120%)，按1.3.3方法制备供试品溶液，按1.3.4确定的色谱条件进样分析.经计算，原花青素的平均加样回收率为99.27%，RSD值为0.85%(<1%)，该结果表明利用本文方法测定原花青素含量的准确度较好.加样回收率的试验结果见表2.

3 结论

本文采用HPLC法测定了不同形态黑果腺肋花楸果实中的原花青素含量，结果显示：新鲜黑果腺肋花楸果实中的原花青素含量为8.6 mg/g，黑果腺肋花楸果实粉末中的原花青素含量为7.0 mg/g，黑果腺肋花楸烘干果实中的原花青素含量为5.2 mg/g.新鲜黑果腺肋花楸果实中的原花青素含量最高的原因可能是原花青素在40 ℃以下时其稳定性较好[4]，而黑果腺肋花楸果实粉末和黑果腺肋花楸烘干果实中的原花青素含量相对较低的原因可能是在烘干(60 ℃)和加工(粉末)果实过程中破坏了果实中的原花青素成分.本文研究结果可为黑果腺肋花楸的开发利用提供参考.