施氮量对烤烟氮代谢关键酶活性的影响

杨楷 郑宏斌 黄莺 冯新维 明堂

摘 要：试验采用土培方式，设置5个氮素水平来研究不同施氮量对烤烟氮代谢关键酶活性的影响。结果表明：施氮量在一定范围内对烤烟氮代谢关键酶活性均有促进作用，但过高则产生抑制，且不同酶、不同生育时期的作用浓度并不相同。移栽后7d，烟叶硝酸还原酶活性（NRa）随施氮量的增加呈先增加后降低的变化趋势，施氮量≤5.45g/株时，增施氮肥可促进NRa，有利于NO.-3向NH3的转化;>5.45g/株时，则因反应产物NO.-2或NH.+4浓度的增加抑制了NRa;烟叶谷氨酰胺合成酶活性（GSa）在旺长期和现蕾期时均随施氮量的增加呈先增加后降低的变化趋势，且GSa分别在5.45g/株、8.18g/株施氮量下达到最大值5.777U/g、18.713U/g，施氮量≤10.91g/株條件下增施氮肥可促进谷氨酸含成酶（GOGATa），≥10.91g/株时，则因Glu浓度过高抑制GOGATa。

关键词：烤烟;施氮量;酶活性

中图分类号：S572文献标识码：A

文章编号：1008-0457（2020）03-0075-05 国际DOI编码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2020.03.013

Effect of Nitrogen Application on the Activity of Key Enzymes in Nitrogen Metabolism of Flue-Cured Tobacco

YANG Kai .1，3，ZHENG Hongbin.2，HUANG Ying .1，3*， FENG Xinwei .1，3， MING Tang .1

（1.College of Tobacoo Science，Guizhou University， Guiyang，Guizhou 550025，China;2.China Tobacco Zhejiang Industrial Co，Ltd.，Hangzhou，Zhejiang 310000，China;3. Key Laboratory of Tobacco Quality Research of Guizhou Province， Guiyang，Guizhou 550025，China）

Abstract：In order to explore the effects of different nitrogen application on the key enzyme activities of nitrogen metabolism in flue-cured tobacco， five nitrogen levels were used to study the effects of different application amount of nitrogen on the key enzyme activities of nitrogen metabolism in flue-cured tobacco by soil culture method. The results showed that the application amount of nitrogen could promote the activity of key enzymes in nitrogen metabolism of flue-cured tobacco within a certain range， but higher amount would produce inhibition effect， and the effect concentrations varied in different enzymes and different growth periods. Seven days after transplanting， NRa of tobacco increased first and then decreased with the increase of nitrogen application. When nitrogen application was ≤5.45g/plant， the additional application of nitrogen could promote NRa， which was beneficial to the conversion of NO.-3 to NH3. When it was >5.45g/plant，NRa was inhibited because of increasing the concentration of NO.-2 or NH.+4. The GSa increased first and then decreased with the increase of nitrogen application during the prosperous period and the bud stage， and that reached the maximum value of 5.777U/g， 18.713U/g under the treatments of 5.45g/plant， 8.18g/plant respectively. The increase of nitrogen application under the condition of nitrogen application ≤10.91g/plant could promote GOGATa.When it was ≥10.91g/plant，GOGATa was inhibited due to excessive Glu concentration.

Keywords：flue-cured tobacco; nitrogen application amount; enzyme activity

氮代谢是烟草最基本、最重要的代谢之一，其代谢强度、协调程度及在烟叶生长发育过程中的变化动态对烟叶品质形成具有重要影响[1-2]。外源氮浓度对烤烟氮代谢关键酶活性有着重要影响，据岳红宾[3]、许晨曦[4]等报道，随着外源氮素水平的提高，叶片中硝酸还原酶（NR）的活性（NRa）有上升趋势，但王红丽等[5]则认为，NR基因的表达量在不同供氮水平间并无明显差异。何文高[6]研究表明，提高施氮量对烟叶中谷氨酰胺合成酶活性（GSa）起到促进作用;曾孝敏[7]的研究表明，随着施氮量的增加，谷氨酸合成酶GOGATa增加，ANDREA等[8]研究认为，谷氨酰胺或天冬酰胺的体内积累对NR基因表达有负调控作用。由此可见，烤煙氮代谢关键酶活性不仅受氮浓度的诱导，还受到产物浓度的制约[9]。氮代谢产物过少或超量积累均不利于烤烟优良品质的形成，目前虽有研究表明氮代谢产物对NR的代谢过程进行反馈调节，但对氮代谢铵同化的反馈调节、施氮量对不同氮代谢产物影响的关联性等少见报道。

为此，通过对不同施氮量下烤烟不同生育时期氮代谢关键酶（NR、GS、GOGAT）活性的测定，进一步探讨烤烟氮代谢关键酶活性在不同施氮水平下的变化规律，以期为烤烟的氮代谢调控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地点与材料

试验于 2018 年在安顺平坝贵州大学-安顺烟草研究基地温室中进行。烤烟品种为云烟87。供试土壤为黄泥土，其基本理化性状见表1。

1.2 试验设计

采用土培试验，设置5个N肥施用水平（以N计），分别是T1：0g/株;T2：5.45g/株;T3：8.18g/株;T4：10.91g/株;T5：13.64g/株，设置3次重复。

土培用紫砂盆钵（30cm×35cm），将风干过2mm筛的土壤12.5kg与烤烟专用复合肥（N：P2O5：K2O=10：11：12）混合后装入，待烟苗四叶一心时，选取健壮均匀长相一致的进行移栽，每盆1株。团棵时再培土2.5kg/盆，同时施入追肥。供试肥料包括基肥与追肥，基肥在装土时施入，追肥在团棵期施入。基肥中氮磷钾肥以烤烟复合肥形式提供，追肥中氮肥、钾肥以烤烟追肥（N：P2O5：K2O=13：0：26）形式提供，其中，氮、磷、钾不足处理分别用尿素、普钙、硫酸钾补足。肥料用量按田间施用量折算为单株施用量（种植密度1100株/667m.2），即氮肥施用量按设计方案施用，磷肥全部用作基肥，施用量为（以P2O5计）5.00g/株，钾肥施用量为14.45g/株（以K2O计）。

1.3 测定方法及仪器

于移栽后7d（伸根期）、旺长期、现蕾期选取烟株中部叶进行酶活性测定。主要仪器：酶标仪（Bio Tek EON） 。测定方法参照文献[10]。

1.4 数据处理

采用Microsoft Excel 2019进行试验数据整理，利用DPS V7.05统计软件分析。

2 结果与分析

2.1 施氮量对烟叶硝酸还原酶活性的影响

因伸根期烟叶样品较少，故该期样品为三次重复的烟叶混合样品。从图1可知，在烤烟移栽后7d，烟叶NRa随施氮量的增加呈先增加后降低的变化趋势;此时烤烟对氮的需求较小，施氮量≤5.45g/株时，增施氮肥可促进NRa，当高于5.45g/株时，可能是由于反应产物NO.-2或NH.+4浓度的增加抑制了NRa。旺长期，NRa随施氮量的增加而增加，不施氮（T1）处理显著低于其他各处理，施氮处理间差异不显著，可能因为此时烤烟对氮素的吸收同化能力增强，反应产物NO.-2或NH.+4浓度虽随着施氮量的增加有所上升，但未对NRa形成抑制。现蕾期，NRa的变化在各施氮水平之间与移栽后7d相似，在施氮量≤8.18g/株范围内，不施氮处理在移栽后7d与T2、T3处理差异不大，而在现蕾期时则显著低于其他处理，可能是因为现蕾期烤烟对氮的吸收量远大于土壤的氮素供应量，而在移栽后7d两者则较为接近，高于8.18g/株时，T4、T5处理NRa均受到反应产物NO.-2或NH.+4的抑制，但现蕾期的抑制作用低于移栽后7d，可能是此时烤烟对氮的吸收同化能力增强所致，对氮素的需求量较大，因此生产上施肥可适当提高基追比以满足烤烟对氮素吸收利用的要求。

2.2 施氮量对烟叶谷氨酰胺合成酶活性的影响

谷氨酰胺合成酶（GS）是处于氮代谢中心的多功能酶，具有转化酶和合成酶两种酶活性，参与多种氮代谢的调节。GS对NH.+4的高亲和力，使GS成为植物体内氨同化的主要途径[11]。从图2可知，移栽后7d，烟叶GSa随施氮量的增加而降低，可能是此时大量的NH.+4促使GS将其合成为谷氨酰胺（Gln），而Gln浓度增加抑制了GSa;在烤烟旺长期和现蕾期，烟叶GSa随生育时期的推进而增加，随施氮量的增加呈先增加后降低的变化趋势，且GSa分别在T2、T3处理时达到最大值为5.777U/g、18.713U/g，不施氮（T1）处理在旺长期时显著高于T5处理，与T3、T4处理间差异不显著，而在现蕾期则显著低于其他各处理，可能是烤烟对NH.+4的同化能力随生育时期的推进而增强，当氮素供应量过多时，现蕾期T4、T5处理的代谢产物Gln对GSa的抑制作用较旺长期时低。

2.3 施氮量对烟叶谷氨酸合成酶活性的影响

谷氨酸合成酶（GOGAT）是植物体内氮素同化与循环的关键酶，也是GS/GOGAT循环过程中的限速酶，在氮同化途径中，催化Gln与α-酮戊二酸转变为谷氨酸（Glu）。从图3可知，各处理烟叶GOGATa在整个生育期均随施氮量的增加呈先增加后降低的变化趋势，移栽后7d，T2处理烟叶GOGATa最高，T5处理最低;烤烟旺长期，不施氮（T1）处理GOGATa显著低于T4处理，其余处理间差异不显著，在施氮量≤10.91g/株范围内，增施氮肥可促进GOGATa，可能是此时氮代谢产物Gln浓度增加促进GOGAT将Gln进一步同化为Glu，而高于10.91g/株时，则因Glu浓度过高抑制了GOGATa;在现蕾期时，GOGATa在T2处理时达到最大值为140.291nmol·min·g，而T5处理GOGATa显著低于其他各处理，且T2与T4、T5间均达到显著性差异，可能是此时烤烟氮代谢强度减弱，对Gln的同化能力下降，因此T5处理的代谢产物Glu对GOGATa的抑制作用相对于旺长期时较强。

3 结论与讨论

氮代谢包括无机氮（硝态氮） 的还原、同化，以及有机含氮化合物的转化、合成等过程。酶作为烟草体内进行各种生物化学反应的最重要物质，催化烟草体内各种生理生化代谢过程的进行。NR是氮代谢途径的关键酶与限速酶，也是烟草氮同化的最初反应催化者[12]，可调节NO.-3的还原，从而调节氮代谢[13]。

硝酸还原酶作为氮代谢过程的第一个酶，其活性较低，对外部条件敏感，较不稳定，所以硝酸还原酶的活力对硝酸还原有一定的限制作用，其活性强弱会直接影响氮代谢能力的高低[14]。本研究移栽后7d，施氮量低于5.45g/株时，NRa随施氮量的增加而增加，当施氮量高于5.45g/株时，可能受到反应产物NO.-2或NH.+4浓度增加的抑制，NRa开始下降;除不施肥（T1）处理外，现蕾期各施氮处理NRa均高于移栽后7d，可能是现蕾期烤烟对氮的吸收同化能力增强[15]，致使烟株体内的氮代谢产物NO.-2或NH.+4浓度降低，对NRa的抑制作用低于移栽后7d，这与凡聪等[16]的研究结果一致。

植物 NH.+4的同化是通过GS与GOGAT协同配合构成的 GS /GOGAT 循环进行的[17]。在氮素同化过程中，GS将NH.+4同化形成谷氨酰胺，然后进一步转化成谷氨酸，形成氨基酸，进而形成不同的蛋白质和转化成含氮碱等含氮化合物[18];GOGAT催化谷氨酰胺-N结合到α-酮戊二酸的α-酮基上生成谷氨酸，高等植物95%以上的NH.+4通过GS/GOGAT循环同化，GOGAT是该途径的限速酶[19-20]。本研究结果表明：移栽后7d，由于GSa在较低供氮水平下仍维持在较高水平，故烟株体内有大量的NH.+4生成，大量的NH.+4促使GS将其合成为Gln，而Gln浓度增加反而抑制了GSa，因此GSa随施氮量的增加而下降。而王红丽等[21]认为，GS基因的表达量在烟叶进入成熟期前随施氮量的增加而增强，这可能与试验设置的氮浓度水平较低有关。在烤烟旺长期和现蕾期，GSa与GOGATa均随施氮量的增加先增加后降低，说明此时氮代谢产物Gln浓度较高，在施氮量5.45g/株范围内，氮代谢产物Gln的浓度增加，促进GOGATa增加的同时对GSa产生了抑制作用，而高于5.45g/株时，GOGATa受到代谢产物Glu浓度增加的抑制，因此其活性降低。各处理烟叶GSa均在现蕾期时达到最大，与葛国锋等[22]研究结果一致，说明烤烟对NH.+4的同化能力随生育时期的推进而增强。当氮素供应量高于8.18g/株時，增施氮肥反而降低GSa，且现蕾期T4、T5处理的代谢产物Gln对GSa的抑制作用相对于旺长期时较低，这一点可从各施氮处理间GOGATa在旺长期时差异不显著和在现蕾期时T5处理显著低于其他各处理得到验证。

在试验设置的氮浓度水平下，在一定施氮量范围内氮浓度对NR、GS、GOGAT等酶活性均有促进作用，但在较高氮水平下反而抑制酶活性。在烤烟生育前期，施氮量对NR和GS的影响具有较高的一致性，即最高施用量为5.45g/株，随着生育期的推进，NRa随施氮量的提高而增加，GS仍在高于5.45g/株后受抑制，这一方面说明烤烟生育后期氮代谢强度逐渐减弱，同时过多的氮素供应会通过GS得以调控。施氮量对GOGAT的影响与NR、GS有较大差异，其抑制效应在高于8.18g/株时才会显现，这可能是因为Gla并不是Gln唯一的代谢产物所致。

综上所述，烟叶氮代谢关键酶活性不仅受到氮用量的调控，还受到相应的氮代谢产物浓度的制约，并且不同酶活性对氮用量的响应是有差异的。

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