大孔树脂富集分离缺陷假单胞菌HD13发酵液中抑制水稻纹枯病菌活性物质的方法研究

杨兴变 郑雯 何珺 康冀川 李洪庆

摘 要：本文建立了一种利用大孔树脂分离富集缺陷假单胞菌HD13发酵液中抑制水稻纹枯病菌活性物质的方法。以水稻纹枯病菌为测試病原菌，采用缺陷假单胞菌HD13发酵液考察D101、LX-60、XDA-6、LSA-12、XDA-8G、LX-17共

6种大孔树脂对HD13菌株发酵液中抑制水稻纹枯病菌活性物质的分离效果。结果表明：XDA-8G树脂对其有很好的分离和富集作用，主要集中在40%乙醇洗脱液中，该方法成本低、操作简单、快速，可为后续大量发酵提供实践依据。

关键词：缺陷假单胞菌发酵液;活性物质;大孔树脂;水稻纹枯病菌

中图分类号：TQ920.6

文献标识码：A

文章编号：1008-0457（2020）02-0085-04 国际DOI编码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2020.03.015

Study on the method for enriching and isolating the inhibiting active substances of Thanatephorus cucumeris from fermantientation broth of Pseudomonasdiminita HD13 by Macro-Porous Adsorption Resin

YANG Xingbian.1， ZHEN Wen.1，2，HE Jun.1，KANG Jichuan.1*，LI Hongqing.3*

（1.Engineering and Research Center of Guizhou Province of China，Guizhou University，Guiyang，Guizhou 550025，China ; 2.College of Pharmacy，Guizhou University，Guiyang，Guizhou 550025，China;3. College of Chemistry and Environmental Science，Guizhou Minzu University，Guiyang，Guizhou 550025，China ）

Abstract：In this paper， a method for separating and enriching inhibiting active substances of Thanatephorus cucumeris from the fermentation broth of Pseudomonasdiminita HD13 by using macroporous resin was established. Using Thanatephorus cucumeris as the test pathogen， six macroporous resins （D101， LX-60， XDA-6， LSA-12， XDA-8G and LX-17） were used to separate the inhibiting active substances of Thanatephorus cucumeris from the fermentation broth of Pseudomonasdiminita HD13.The results showed that XDA-8G resin had a good separation and enrichment effect. The inhibiting active substances were concentrated in the 40% alcohol eluent. The method has low cost， simple and fast operation， and can provide practical basis for subsequent large-scale fermentation.

Keywords：the fermentation broth of Pseudomonasdiminita; active substances; macroporous resin;Thanatephorus cucumeris

缺陷假单胞菌属于假单胞杆菌科，假单胞杆菌属，球菌类型，是一种常见的革兰氏阴性好氧杆菌，能够利用多种有机物，为自身提供碳源和能源。因而在自然界中分布十分广泛，其专性需氧，可在植物根系内部建立种群并抑制其它微生物的生长，其产生的 2，4-二乙酰滕黄酚、藤黄绿菌素、吩嗪类、脂多肽、硝吡咯菌素、氢氰酸等类型的次级代谢产物对多种微生物具有抑制作用[1-3]。BURR等[4]报道荧光假单胞菌对甜菜、马铃薯等作物具有增产作用;WELLER等[5]

利用荧光假单胞菌防治小麦全蚀病;THOMASSHOW等[6]利用恶臭假单胞菌抑制镰刀菌厚垣孢子的萌发;杨艺炜[7]发现绿针假单胞菌对烟草黑胫病及其游动孢子有抑制作用。此外，假单胞菌属对棉花黄萎病、水稻稻瘟病、水稻鞘腐病、烟草黑胫病、小麦全蚀病、番茄斑萎病毒等均有较好的防治效果[8-11]。

微生物来源广，生长周期短，可通过大规模发酵实现工业化生产，与动植物相比，具有潜在的产业化优势。微生物

及其代谢产物的多样性，为发现新药以及先导化合物提供了丰富的资源[12]。然而，发酵液中含有众多次级代谢产物的同时，也存在众多成分不明及复杂的天然基质，诸如牛肉膏、蛋白胨等。因此，从发酵液中分离和纯化得到高纯度的微生物活性物质是研发工作的最终目标，而建立其活性物质快速富集与分离的方法对实现这一最终目标具有非常重要的意义。

缺陷假单胞菌HD13是贵州省生化工程中心真菌室从微生物菌剂中得到的一株拮抗细菌。初步研究表明，该菌株对水稻纹枯病菌、烟草黑胫病、辣椒灰霉病、番茄黑斑病、水稻稻疫病、小麥赤霉病、辣椒炭疽病、番茄早疫病等多种植物病原菌均具有拮抗活性，对水稻纹枯病菌抑菌活性最为显著，且发酵产物稳定性良好。唐远江等

[1]将缺陷假单胞菌HD13菌株30 ℃发酵4 d后，对发酵液进行过滤、浓缩，再经石油醚、氯仿、正丁醇等不同有机试剂萃取、硅胶层析柱分离、浸提等步骤分离得到活性组分[1]，该方法成本高、操作繁琐、耗时长。因此，本文以水稻纹枯病菌为测试病原菌，考察D101、LX-60、XDA-6、LSA-12、XDA-8G、LX-17等6种大孔树脂对HD13菌株发酵液中抑制水稻纹枯病菌活性成分的富集与分离效果，以期筛选到其富集和分离效果最佳的树脂，进一步简化实验程序，为后续研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 供试菌株

缺陷假单胞菌（Pseudomonasdiminita）HD13，水稻纹枯病病原菌（Thanatephorus cucumeris）WK，均保藏于贵州省生化工程中心。

1.1.2 供试树脂

供试树脂为非极性（D101，LX-60）、弱极性（XDA-6，LSA-12）、极性（XDA-8G，LX-17），均由西安蓝晓科技新材料股份有限公司提供。

1.1.3 供试试剂

工业乙醇（95%）、HCL（贵州省生化工程中心易制毒实验室提供）、NaOH（分析纯）、蒸馏水（贵州省生化工程中心中试基地）。

山地农业生物学报2020年

1.1.4 培养基

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA） 、 营养肉汤（NB）固体培养基、营养肉汤（NB）液体培养基。

1.2 实验方法

1.2.1 水稻纹枯病病原菌（WK）的活化

将WK菌种接种于9 cm的PDA培养皿中，28 ℃暗培养，待菌丝体长满培养皿，4 ℃保存备用。

1.2.2 缺陷假单胞菌HD13发酵液的制备

将菌株HD13接种于NB固体培养基中，30 ℃培养24 h活化。制备NB液体培养基，于121 ℃灭菌30 min后接种活化好的菌株，30 ℃、120 r/min摇床培养24 h作为种子液。将HD13的种子液以1%的接种量接种于装有2 L NB液体培养基的发酵瓶中，作为发酵液于30 ℃、120 r/min摇床培养3 d。

1.2.3 不同型号大孔树脂对发酵液抑菌活性成分的影响

取HD13发酵液120 mL加入活化好的树脂（20 g）柱中，控制流速在1.5 mL/min左右，以20 mL为单位接取流出液6份，分别浓缩至干，称重;再分别用20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇、无水乙醇各120 mL依次冲洗，收集各组分洗脱液，并将各组分洗脱液与原发酵液分别浓缩至干，称重。

1.2.4 活性实验

采用菌丝生长抑制法进行抑菌活性的测定。具体方法为：试验组加入0.05 g流出液或洗脱液浓缩物，对照组加入0.05 g HD13发酵液浓缩物，空白组加入0.05 g蒸馏水，加入比例适当的琼脂粉及马铃薯葡萄糖琼脂粉2.4 g，60 mL蒸馏水，充分摇匀，121 ℃灭菌，再在无菌条件下，倒入直径为9 cm的培养皿中，制成含药培养基、对照培养基及空白培养基，每个做3组平行。待培养基冷却凝固，在无菌条件下，用直径7 mm打孔器在培养好的WK菌落边缘切取菌饼，用接种针将切取的菌饼正放于培养皿中央，盖上皿盖，倒置于培养箱中，28 ℃下培养至空白组菌丝体长满培养皿。通过十字交叉法测定菌落直径，按下列公式计算WK菌丝生长的抑制率[13]。

2 结果与分析

由表1可知，发酵液经D101、LX-60、 XDA-6、LSA-12树脂处理后，其重量主要分布在20%乙醇洗脱部分，发酵液经XDA-8G树脂处理后，其重量主要分布在20%及40%乙醇洗脱部分，发酵液经LX-17树脂处理后，其重量主要分布在流出液部分，说明LX-17树脂对发酵液中物质基本不吸附。从各型号树脂流出液的重量合计来看，各型号树脂对发酵液中物质的吸附能力为XDA-8G>D101> LX-60> LSA-12> XDA-6>LX-17。

表2、表3试验结果表明，D101、LX-60、XDA-6、LSA-12、LX-17型号大孔树脂对缺陷假单胞菌HD13发酵液中抑制水稻纹枯病菌的活性物质基本无富集作用。经XDA-8G处理后，抑制水稻纹枯病菌的活性物质主要集中在40%的乙醇洗脱部分，其抑制率达到37.3%，是发酵液的6.2倍，说明用XDA-8G处理能起到很好的富集和分离作用。

3 结论与讨论

利用大孔树脂处理假单胞菌发酵液的研究不多。翟熙伦[14]利用D101大孔树脂对蒙氏假单胞菌发酵液进行吸附，用不同浓度甲醇进行洗脱，并进行生物学测定，随着甲醇浓度升高，洗脱物质的活性下降，说明目标活性物质与其他杂质得到了有效的分离。杨松等[15]利用非极性大孔树脂sp207除去铜绿假单胞菌发酵液中醇溶性糖类物质，利用阴离子交换树脂吸附铜绿假单胞菌发酵液中产酰化高丝氨酸内酯信号分子抑制剂，并取得了较好的分离效果。

本文通过考察6种大孔树脂对缺陷假单胞菌HD13发酵液中抑制水稻纹枯病菌活性物质的富集和分离效果，发现XDA-8G对其具有很好的富集和分离作用，其主要集中在40%的乙醇洗脱部分，该洗脱部分干重为0.4615 g，为总发酵液干重质量的26.5%;且抑制率达到37.3%，是发酵液的6.2倍，说明用XDA-8G处理能将HD13发酵液中大部分的抑制水稻纹枯病菌活性物质富集起来，且活性物质集中在40%的乙醇洗脱部分。与唐远江等[1]对缺陷假单胞菌HD13发酵液进行过滤、浓缩，再经石油醚、氯仿、正丁醇等不同有机试剂萃取、硅胶层析柱分离、浸提等实验步骤分离得到活性组分相比，该方法成本低、操作简单、试验周期短，可为后续大量发酵提供依据。

参 考 文 献：

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