肿瘤浸润性免疫细胞对肺腺癌预后影响的研究

施春波 董长征 陈磊 翁磊

肺癌是全世界癌症相关死亡的主要原因之一[1]。非小细胞肺癌是肺癌中最常见的亚型，其组织学亚型又以肺腺癌多见。目前关于肺腺癌治疗与预后评估主要依据TNM分期，而手术切除是早期肺腺癌的治疗手段[2]；虽然手术切除可以提高生存率，但是仍有近1/4的患者出现复发[3-4]。因此，准确评估肺腺癌复发风险具有重要意义。免疫反应是许多特异性细胞之间相互协调的过程，对肺腺癌临床结局可造成一定的影响[5]。据报道，肿瘤浸润性免疫细胞（简称免疫细胞）的功能和组成会随着宿主免疫状态变化而改变，并可能成为特定药物的有效靶点。CIBERSORT（通过估计RNA转录物的相对亚群来识别细胞类型）是一种基于基因表达的反卷积算法，利用一组条形码基因表达值来表示免疫细胞组成。与传统的免疫组化、流式细胞术等试验方法相比，CIBERSORT能全面、快速、准确地推断22种免疫细胞在肿瘤中的相对浸润比例[6]。近年来有不少研究采用该方法探讨22种免疫细胞对预后的影响[7-9]。本研究利用CIBERSORT计算肺腺癌中22种免疫细胞的浸润比例，并构建免疫风险评分模型及列线图来预测肺腺癌的复发风险，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 TCGA数据获取 本研究肺腺癌转录组数据来源于公共数据库TCGA[10]。通过UCSC Xena网站（https://xenabrowser.net/）输入关键词“肺腺癌”下载TCGA数据库中594例肺腺癌患者的转录组数据，包括正常肺组织样本59例,肺腺癌组织样本535例。同时获取523例肺腺癌患者的临床资料，包括性别、年龄、TNM分期、预后等。最后利用R软件的limma包对下载的肺腺癌转录组数据进行校正。

1.2 肿瘤中免疫细胞浸润状态评估 利用CIBERSORT软件对校正后的肺腺癌转录组数据中22种免疫细胞的相对浸润比例进行推算。首先，将校正后的转录组数据上传到CIBERSORT网站（http://cibersort.stanford.edu/），将算法设置为1 000排。数据集中每个样本将会得到一个P值，最终筛选出P＜0.05的样本作进一步研究。

1.3 统计学处理 采用SPSS 23.0和R 3.5.3统计软件。符合正态分布的连续变量比较，采用两独立样本t检验；呈偏态分布的连续变量比较，采用Mann-Whitney U检验。绘制Kaplan-Meier曲线，采用log-rank检验比较不同复发风险患者的总生存率。绘制ROC曲线分析复发预测模型的诊断效能。单因素Cox回归模型用于分析单个变量对生存的影响，多因素Cox回归模型用于分析与生存相关的独立预测因子，利用Cox回归模型分析中的回归系数构建列线图。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 22种免疫细胞在正常肺组织与肺腺癌组织中的差异表达 利用CIBERSORT筛选出517例P＜0.05的样本进行研究，其中正常肺组织样本56例，肺腺癌组织样本461例。对22种免疫细胞在正常肺组织、肺腺癌组织中的表达进行比较，结果显示除CD8+T细胞、幼稚的CD4+T细胞、激活的自然杀伤细胞（NK细胞）及激活的肥大细胞外，其余免疫细胞在正常肺组织与肺腺癌组织中的表达比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图1a（插页）。主成分分析结果显示，正常肺组织与肺腺癌组织的免疫浸润情况有明显的组偏聚类和个体差异，见图1b（插页）。

图1 肿瘤浸润性免疫细胞在正常肺组织与肺腺癌组织中的差异表达（a：小提琴图，蓝色代表正常肺组织，红色代表肺腺癌组织，NK细胞为自然杀伤细胞；b：主成分分析图，红色代表正常肺组织，绿色代表肺腺癌组织）

图2 免疫风险评分模型（a：Kaplan-Meier生存曲线；b：ROC曲线；c：风险评分；d：生存状态；e：免疫浸润模式）

2.2 22种免疫细胞对肺腺癌患者预后的影响 利用单因素Cox回归模型对22种免疫细胞进行分析，以寻找与肺腺癌总生存有统计学差异的预后亚群。结果显示嗜酸性粒细胞（HR=4.08E+17，95%CI：1 560.24～1.07E+32，P＜0.05）、激活的树突状细胞（HR=79.44，95%CI：1.54～4 107.17，P＜0.05）、M1 型巨噬细胞（HR=30.42，95%CI：1.24～747.63，P＜0.05）均与肺腺癌预后较差有关，见表1。

2.3 基于3种免疫细胞的免疫风险评分模型构建与评价 假设上述单因素Cox回归分析筛选的3种免疫细胞对肺腺癌的总体生存有影响，将这3种免疫细胞作为一个独立的预测信号来预测患者的复发风险。采用多因素Cox回归法对这3种免疫细胞构建免疫风险评分模型。根据模型对每例患者进行复发风险评分，按风险评分中位值将患者分为高风险组与低风险组，Kaplan-Meier曲线提示高风险组患者总生存率低于低风险组，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2a（插页）。ROC曲线显示，该风险模型在预测复发风险方面具有较好的诊断效能（AUC=0.60），见图2b（插页）。肺腺癌患者的风险评分、生存状态及免疫浸润模式见图2c-e（插页）。

表1 22种肿瘤浸润性免疫细胞对肺腺癌患者预后的影响

2.4 免疫风险评分模型对肺腺癌预后的独立预测价值 为探索构建的免疫风险评分模型对肺腺癌预后风险的预测是否独立于患者年龄、性别、TNM分期等临床病理参数，笔者对免疫风险评分、年龄、性别、TNM分期进行了多因素Cox回归分析。结果显示免疫风险评分模型（HR=1.30，95%CI：1.20～1.40，P＜0.05）、TNM 分期（HR=1.70，95%CI：1.49～2.10，P＜0.05）是肺腺癌预后的独立预测因子。

2.5 预测肺腺癌患者生存率的列线图构建 建成的预测肺腺癌患者生存率的列线图见图3。

3 讨论

除恶性肿瘤细胞外，癌组织还包括免疫细胞、成纤维细胞、内皮细胞以及大量细胞因子、趋化因子、生长因子。这些组件及它们之间的相互作用构成了肿瘤微环境。肿瘤微环境对恶性细胞具有抑制作用，但是肿瘤细胞在进展过程中会避开这些抑制性信号，利用免疫细胞及其他有利条件促进自身的生长、侵袭及转移[11]。众所周知，在免疫细胞和肿瘤基质中的恶性细胞之间，事实上存在着复杂的生物学过程，且具有明显的预后相关性。例如在结直肠癌患者中，M1型巨噬细胞及激活的树突状细胞与较好的预后相关，而M2型巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞与预后不良相关[12]。Zhou等[9]基于免疫细胞构建了预后免疫风险评分模型，该模型是结肠癌患者无复发生存的独立预测因子，且较TNM分期有更好的预测价值。

图3 预测肺腺癌患者生存率的列线图

手术切除后肿瘤复发是影响肺腺癌患者总生存的重要因素之一。因此，准确评估患者复发风险对于肺腺癌患者总生存的改善至关重要。为了全面探索免疫细胞预测肺腺癌患者预后的价值，笔者采用CIBERSORT对肺腺癌组织中22种免疫细胞的相对浸润比例进行推算，并选取P＜0.05的样本用于研究。单因素Cox回归分析显示，嗜酸性粒细胞、激活的树突状细胞及M1型巨噬细胞均与肺腺癌患者较差的预后相关。基于这3种免疫细胞，笔者采用多因素Cox回归模型构建了免疫风险评分模型，而ROC曲线分析显示该模型预测肺腺癌复发风险是可靠的。此外，本研究发现幼稚B细胞、记忆B细胞、浆细胞、CD4+T细胞、滤泡辅助T细胞、调节性T细胞、NK细胞、肥大细胞、单核细胞等对肺腺癌预后的预测价值虽然不大，但是在正常肺组织与肺腺癌组织中存在差异表达，表明这些细胞与肺腺癌的发生、发展密切相关。

综上所述，本研究证明了免疫细胞在肺腺癌预后评估中的价值，本文基于3种免疫细胞构建的免疫风险评分模型是肺腺癌预后的独立预测因子。但本研究不可避免地存在一定的局限性：（1）公开数据库集中发布的数据量有限，本研究用于分析的临床病理参数不全面，可能导致潜在的错误或偏倚；（2）未考虑与免疫浸润位置相关的免疫微环境的异质性；（3）为构建免疫风险评分模型而下载的所有数据均来自西方国家，因此该研究成果在亚洲国家患者身上不一定适用，需要进一步研究加以验证。