胞嘧啶核苷二磷酸胆碱对新生大鼠坏死性小肠结肠炎的治疗作用

赖盼建 张维溪 李小兵

坏死性小肠结肠炎（necrotizing enterocolitis，NEC）是新生儿科常见的急危重症之一，死亡率高达20%～30%[1]。近年来，NEC发病率有增加趋势，可能与其发病机制尚不清楚有关。早产、低体重和配方奶喂养等被认为是NEC的高风险因素，与新生儿（尤其是早产儿）肠黏膜损伤有关。目前临床上主要采取支持治疗，但预后不理想[2]。现有研究表明，NEC肠黏膜损伤可能是氧自由基介导的炎症因子释放的结果，包括TNF、血小板活化因子、IL等；而且发现炎症因子的释放、炎症反应以及活化的多形核白细胞的迁移会导致活性氧过量产生。这些活性物质的有害作用通过多种机制（包括细胞膜脂质过氧化和细胞蛋白氧化等途径）损伤细胞并诱导细胞死亡[3]。磷脂酰胆碱是胃肠黏膜屏障的主要脂质，对黏膜有保护作用，并调节炎症信号系统。实验表明，磷脂层缺陷或损伤可引起炎症，易导致NEC[4]。因此，笔者推测外源性磷脂酰胆碱对NEC有一定的治疗作用。故本研究拟采用胞嘧啶核苷二磷酸胆碱（CDP-胆碱）干预NEC新生大鼠模型，以探讨CDP-胆碱对NEC所致的肠道炎症、肠黏膜损害及坏死的治疗作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物 新生（3日龄）清洁级SD大鼠40只，由浙江省医科院实验动物中心提供[许可证号：scxk（浙）20140001]，均饲养在无特定病原体环境中。本研究经金华市食品药品检验检测研究院动物实验伦理委员会审查通过。

1.2 主要试剂与仪器 Beclin-1抗体（ab55878）和LC3Ⅱ抗体（ab128025）购自英国Abcam公司；驴抗兔二抗（A21206）购自美国Life Technology公司；ELISA试剂盒（CSB-E11987r、CSB-E08055r、CSB-E04640r）购自武汉华美生物工程有限公司。显微镜（BX53）购自日本OLYMPUS公司；酶标仪（Model680）购自美国BIO-RAD公司。

1.3 动物分组及处理 40只大鼠按随机数字表法分成4组，每组10只。（1）空白对照组：正常母鼠喂养，无任何干预措施[5]。（2）NEC对照组：脱离母鼠、采用配方奶进行人工滴灌喂养，3次/d；依次用CO2（流量4 L/min）灌笼约10 min（直至动物肤色变紫）、O2（流量4 L/min）灌笼约8 min（直到动物肤色转红、呼吸恢复）、0℃冰箱中放置5 min，每日晨晚各1次，间隔12 h；腹腔注射0.9%氯化钠注射液，1次/d，剂量30 ml/（kg·d）。（3）CDP-胆碱治疗组：脱离母鼠、采用配方奶进行人工滴灌喂养，3次/d；依次用CO2（流量4 L/min）灌笼约10 min（直至动物肤色变紫）、O2（流量4 L/min）灌笼约8 min（直到动物肤色转红、呼吸恢复）、0℃冰箱中放置5 min，每日晨晚各1次，间隔12 h；腹腔注射CDP-胆碱注射液（2 ml∶0.1 g，国药准字 H22026207，吉林百年汉克制药有限公司），1次/d，剂量0.1 ml/（kg·d）。（4）CDP-胆碱对照组：正常母鼠喂养，同时腹腔注射CDP-胆碱注射液，1次/d，剂量0.1 ml/（kg·d）。实验第7天采用腹腔注射过量水合氯醛处死大鼠，打开腹腔并从幽门后5 cm处开始往下取1 cm肠段进行肠道组织病理学观察，再往下取4 cm肠段进行肠道组织细胞自噬程度检测和炎症因子水平检测。

1.4 肠道组织病理学检测 肠段用4%多聚甲醛固定72 h，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡包埋，6 μm切片，常规HE染色，树胶封片，置于光镜下观察并进行组织学评价。采用Shiou评分法[6]：肠黏膜绒毛完整，组织结构正常为0分；轻微的黏膜下和（或）固有层肿胀分离为1分；中度的黏膜下和（或）固有层分离，黏膜下和（或）肌层水肿为2分；重度的黏膜下和（或）固有层分离，黏膜下和（或）肌层水肿，局部绒毛脱落为3分；肠绒毛消失伴肠坏死为4分。

1.5 肠道组织细胞自噬程度检测 采用免疫荧光法。肠道组织常规切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇复水，抗原修复，滴加相应的Beclin-1和LC3Ⅱ抗体，4℃孵育过夜，PBS水洗3×3 min，并设PBS作为阴性对照；滴加二抗，37 ℃孵育 60 min，PBS 冲洗 3×5 min；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染核，室温10 min；甘油PBS封片；置于荧光显微镜下观察。蓝色为细胞核，绿色荧光为Beclin-1和LC3Ⅱ。Beclin-1和LC3Ⅱ荧光强度越强，表示自噬越严重。

1.6 肠道组织炎症因子水平检测 采用ELISA法。肠段称重后进行匀浆，4℃、12 000 g离心20 min；取上清液检测TNF-α、IL-6和IL-1β水平。按照说明书步骤测定各样本孔的吸光度（OD），利用标准品的OD值和浓度绘制标准曲线并转化出公式，最后根据所测样本的OD值计算其浓度。

1.7 统计学处理 采用SPSS 21.0统计软件。计量资料用表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4组大鼠肠道组织病理学观察 空白对照组、CDP-胆碱治疗组和CDP-胆碱对照组大鼠肠黏膜上皮连续、完整，细胞与腺体排列规则，未见炎症细胞浸润；NEC对照组大鼠肠绒毛普遍水肿，黏膜及黏膜下层可见以中性粒细胞为主的大量炎症细胞，毛细血管有扩张，血管外可见红细胞，部分肠上皮细胞消失，见图1（插页）。4组大鼠肠道组织Shiou评分比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；其中NEC对照组 Shiou评分明显高于其他3组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；而CDP-胆碱治疗组、CDP-胆碱对照组、空白对照组之间两两比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表1。

表1 4组大鼠肠道组织Shiou评分比较（分）

2.2 4组大鼠肠道组织细胞自噬程度比较 在相同检测条件下，NEC对照组大鼠肠道组织Beclin-1、LC3Ⅱ荧光强度明显增强，而CDP-胆碱治疗组、CDP-胆碱对照组、空白对照组间荧光强度差异不明显，见图2-3（插页）。

图1 4组大鼠肠道组织病理学观察所见（NEC为坏死性小肠结肠炎，CDP-胆碱为胞嘧啶核苷二磷酸胆碱；a：空白对照组；b：NEC对照组；c：CDP- 胆碱治疗组；d：CDP- 胆碱对照组；HE 染色，×200）

图2 4组大鼠肠道组织Beclin-1荧光强度比较（NEC为坏死性小肠结肠炎，CDP-胆碱为胞嘧啶核苷二磷酸胆碱；a：空白对照组；b：NEC对照组；c：CDP-胆碱治疗组；d：CDP-胆碱对照组；免疫荧光法，×400）

图3 4组大鼠肠道组织LC3Ⅱ荧光强度比较（NEC为坏死性小肠结肠炎，CDP-胆碱为胞嘧啶核苷二磷酸胆碱；a：空白对照组；b：NEC对照组；c：CDP- 胆碱治疗组；d：CDP- 胆碱对照组；免疫荧光法，×400）

2.3 4组大鼠肠道组织炎症因子水平比较 4组大鼠肠道组织TNF-α、IL-1β、IL-6水平比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；其中NEC对照组上述炎症因子水平均明显高于其他3组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；而CDP-胆碱治疗组、CDP-胆碱对照组、空白对照组之间两两比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表 2。

表2 4组大鼠肠道组织炎症因子水平比较（ng/L）

3 讨论

NEC是新生儿科常见的胃肠道急危重症之一，病死率较高。研究表明，NEC肠道组织损害是由于非自然状态下的肠道组织受到了伤害性刺激，机体产生了大量的氧自由基，在氧自由基的介导下各种炎症因子大量释放，使肠道组织发生炎性损害[4]。本研究采用CO2灌笼再转为O2灌笼最后低温刺激2次/d的干预方式建立大鼠NEC模型，同时使用CDP-胆碱治疗，结果发现NEC对照组肠道组织TNF-α、IL-1β、IL-6水平明显高于其他3组，提示TNF-α、IL-1β和IL-6等炎症因子在NEC大鼠的肠道组织损伤甚至细胞死亡过程中扮演了重要角色。使用CDP-胆碱进行干预后，TNF-α、IL-1β和IL-6等炎症因子水平明显下降，提示CDP-胆碱对改善NEC大鼠的肠道组织炎症反应具有明确的作用。

磷脂酰胆碱是一种位于胃肠道黏膜与黏液层之间的主要脂质，对黏膜具有保护作用，并调节炎症信号系统。NEC的发生与磷脂层缺陷或损伤有关，有研究表明外源性磷脂酰胆碱给药对溃疡性结肠炎具有良好的疗效[4-5]。而CDP-胆碱在磷脂酰胆碱的合成中起着重要作用，同时与甘油二酯水平的升高和游离脂肪酸的降低有关，临床上常作为脑细胞代谢激活剂，特别对于迟发性神经损伤、防止凋亡调控因子Caspase-3的活化和减少细胞凋亡具有重要意义[7-8]。本实验结果发现，CDP-胆碱对NEC炎症反应有一定的保护效应。Cetinkaya等[9]也报道了NEC大鼠肠损害时肠道组织膜磷脂减少，而CDP-胆碱能明显提高总磷脂和磷脂酰胆碱水平。

研究证实，早产儿NEC发病早期往往会发生肠黏膜上皮细胞的通透性增加，该事件会启动一系列细胞凋亡过程，同时出现自噬现象[10]。细胞中出现自噬体是自噬的标志，主要由微管相关蛋白LC3Ⅱ介导形成[11]。而Beclin-1是Ⅲ型PI3-激酶复合物的主要成分，在细胞自噬泡的形成过程中必不可少，被认为是一种能代表自噬水平的标志物[12]。本研究发现，NEC对照组大鼠肠道组织中微管相关蛋白LC3Ⅱ及自噬基因Beclin-1荧光强度明显增强，而CDP-胆碱治疗组、CDP-胆碱对照组、空白对照组间荧光强度差异不明显，提示CDP-胆碱可下调NEC大鼠肠道组织细胞自噬水平。已有实验在NEC动物模型中证实细胞凋亡是细胞自噬的一种延续[10]，提示CDP-胆碱可有效保护肠道细胞在病理刺激下的调亡。另有研究发现，大鼠NEC疾病模型与临床病例的回肠部位肠黏膜上皮细胞自噬过程被激活[13]。

综上所述，CDP-胆碱能有效抑制TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症因子的表达，从而使受损肠道的级联炎症反应难以持续，同时还能降低肠黏膜细胞的自噬水平，从而减少细胞凋亡，这说明CDP-胆碱对新生大鼠NEC有明显治疗作用。