酸性蛋白酶在玉米燃料乙醇浓醪发酵中的应用*

惠继星，岳 军，宁艳春，陈希海，王 硕，屈海峰，胡世洋，范 锐

(1.中国石油吉林石化公司 研究院，吉林 吉林 132021；2.吉林燃料乙醇有限责任公司，吉林 吉林 132101)

近年来，随着国家对定点燃料乙醇生产企业补贴标准的逐步降低，乙醇发酵工业更多将焦点放在提高生产效益，降低生产成本[1-4]。据公开文献测算，发酵醪乙醇体积分数(玉米为原料)每提高1%，乙醇收益增加30～40元/t[5]，乙醇浓醪发酵一般是指φ(乙醇)>12%的发酵生产[6]，采用浓醪发酵法生产乙醇对生产企业提高效益，降低能耗，提高设备利用率，保护环境具有积极的促进作用，目前已经成为国内酒精行业的发展趋势[7]。

氮源是制约玉米酒精发酵速率和成熟醪酒份的主要因素，在传统的酒精生产中，酵母生长所需要的氮源采用尿素。随着GB2760—2014的实施，尿素禁止在食用乙醇生产过程中使用[8]。对于玉米燃料乙醇生产企业而言，尿素可能会随着副产品(玉米酒糟饲料DDGS)进入食品环节，威胁人体健康，因此玉米乙醇领域急需开发出替代尿素的新型氮源[9-10]。以玉米为原料生产酒精时，在发酵过程中添加适量的酸性蛋白酶，能有效地水解原料中的蛋白质，破坏原料细胞壁结构，利于糖化酶的作用，使原料中可利用的糖增加，提高出酒率。同时，由于蛋白酶的水解作用，增加了醪液中可被酵母利用的有机氮，促进酵母的生长和繁殖，增强酵母菌的产酒能力，提高发酵速度，缩短发酵周期[11]。有关酸性蛋白酶应用方面的报道较多，但是将酸性蛋白酶应用于玉米燃料乙醇浓醪发酵的报道较少。作者研究了玉米糖化醪初始pH值、w(糖化醪干物)、酸性蛋白酶添加量等条件对乙醇发酵过程的影响，得到较适宜的w(糖化醪干物)和酸性蛋白酶添加量，为玉米燃料乙醇浓醪发酵的中试放大及工业化实验提供参考。

1 实验部分

1.1 原料、试剂与仪器

玉米粉、酸性蛋白酶：酶活力5×104U/mL，糖化酶：10×104U/mL；耐高温α-淀粉酶：24×104U/mL，均为市售；超级酿酒高活性干酵母：湖北安琪酵母股份有限公司。

磷酸：辽宁新兴试剂有限公司；氢氧化钠：北京化工厂；均为分析纯。

立式全温振荡培养箱：ZQPL-200，天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司；洁净工作台：SW-CJ-1FD，苏州净化设备有限公司；高压灭菌锅：MJ-78A，施都凯仪器设备(上海)有限公司；离心机：A14，Sartorius公司；液相色谱：LC-20A，日本岛津公司；数字酸度计：PP-25-P11，Sartorius公司；快速水分测定仪：MS-70，日本AND公司。

1.2 实验方法

1.2.1 原料液化、糖化

按照一定的w(糖化醪干物)，将市售玉米粉用60～70 ℃温水调浆；95 ℃糊化液化120 min，液化酶加量为30 U/g玉米粉；60 ℃恒温糖化60 min，糖化酶加量为70 U/g玉米粉，得到玉米糖化醪。

1.2.2 pH值调整

利用磷酸、氢氧化钠溶液调节玉米糖化醪的pH值。

1.2.3 酵母活化

称量0.3 g安琪超级酿酒高活性干酵母，加入装有100 mL无菌水的三角瓶中，在t=32 ℃、n=180 r/min的摇床中活化60 min。

1.2.4 发酵

向100 mL玉米糖化醪中加入1 mL酵母活化液，加入适量的酸性蛋白酶，在n=180 r/min、t=32 ℃的条件下开始发酵。

1.3 分析方法

1.3.1φ(乙醇)和ρ(葡萄糖)测定

取发酵液样品1.8 mL加入2.0 mL离心管中，n=12 000 r/min，离心3 min，取上清液稀释10倍，然后用0.22 μm的水系滤膜过滤，用液相色谱仪(检测器：示差折光检测器；流速：0.6 mL/min；流动相：0.005 mol/L硫酸；柱温：55 ℃)测定发酵液中φ(乙醇)和ρ(葡萄糖)，按公式(1)、(2)计算。

φ(乙醇)=φ×稀释倍数/100

(1)

ρ(葡萄糖)=φ×稀释倍数/100

(2)

式中：φ为测定值。

1.3.2w(糖化醪干物)测定

w(糖化醪干物)的测定参照GB/T2793—1995，干燥温度为105 ℃。

2 结果与讨论

2.1 初始pH值对酸性蛋白酶作用效果的影响

在w(糖化醪干物)=27%、酸性蛋白酶添加量为 0.10 kg/t干物的条件下，考察了发酵液的初始pH值对乙醇发酵过程的影响，发酵前后发酵液pH值的变化见表1，发酵液中φ(乙醇)随时间的变化见图1，ρ(葡萄糖)随时间的变化见图2。

表1 发酵前后各发酵液的pH值

t/h图1 φ(乙醇)随时间的变化

t/h图2 ρ(葡萄糖)随时间的变化

由表1可知，发酵后各实验的pH值均较发酵前有所降低，表明乙醇发酵是产酸的过程。由图1、图2可知，初始pH=3.5～6.0的φ(乙醇)曲线和ρ(葡萄糖)曲线均发生了重叠，表明初始pH=3.5～6.0对酸性蛋白酶作用效果的影响差别不大；当发酵液的初始pH=3.0时，相对于初始pH=3.5～6.0发酵液的φ(乙醇)明显降低，相应发酵液中ρ(葡萄糖)明显升高，表明当发酵液初始pH<3.5会对酸性蛋白酶的作用效果产生不良影响，因此发酵液初始pH值不宜低于3.5。由于糖化醪的初始pH=5.5，因此酸性蛋白酶适宜于玉米燃料乙醇发酵，在酸性蛋白酶的应用过程中无需对发酵液的pH值进行调整。

2.2 w(糖化醪干物)对乙醇发酵过程的影响

在w(糖化醪干物)=27%、29%、31%、33%、35%，不添加酸性蛋白酶的条件下进行乙醇发酵实验，发酵液中φ(乙醇)随时间的变化见图3，ρ(葡萄糖)随时间的变化见图4。

t/h图3 φ(乙醇)随时间的变化

t/h图4 ρ(葡萄糖)随时间的变化

由图3、图4可知，随着w(糖化醪干物)的增大，最终发酵液中φ(乙醇)逐渐升高，φ(乙醇)达到最大值的时间后移，发酵周期延长。w(糖化醪干物)=27%，发酵液中φ(乙醇)在48 h达到最大值11.5%；w(糖化醪干物)分别为29%、31%时，发酵液中φ(乙醇)均在56 h达到最大，分别为12.7%、13.8%；w(糖化醪干物)=33%，发酵液中φ(乙醇)在72 h达到最大值14.1%，此时ρ(葡萄糖)=1.0 g/L；w(糖化醪干物)=35%，发酵液中φ(乙醇)在56 h达到最大值13.9%，发酵停止，此时为ρ(葡萄糖)=37.2 g/L，表明当w(糖化醪干物)过高时，物料的流动性变差，醪液在搅拌、输送和加热冷却时都变得十分困难，不利于酵母菌的生长繁殖[12-14]。

2.3 酸性蛋白酶对乙醇发酵过程的影响

在w(糖化醪干物)=27%、29%、31%、33%、35%，每100 mL糖化醪中添加4 μL酸性蛋白酶的条件下进行乙醇发酵实验，发酵液中φ(乙醇)随时间的变化见图5，ρ(葡萄糖)随时间的变化见图6。

t/h图5 φ(乙醇)随时间的变化

t/h图6 ρ(葡萄糖)随时间的变化

由图5、图6可知，当w(糖化醪干物)分别为27%、29%、31%、33%时，发酵液中φ(乙醇)均在48 h达到最大，分别为11.5%、12.6%、13.8%、14.6%；当w(糖化醪干物)=35%时，发酵液中φ(乙醇)在56 h达到最大14.7%，此时发酵液中ρ(葡萄糖)为17.7 g/L，表明添加酸性蛋白酶改善了发酵液的营养状况，促进了酵母菌的生长繁殖，有利于提高乙醇发酵速率，但是当w(糖化醪干物)过高时，较高的φ(乙醇)是抑制酵母菌的生长繁殖的主要因素。

2.4 酸性蛋白酶对乙醇发酵周期的影响

对不同w(糖化醪干物)条件下添加酸性蛋白酶和空白实验的发酵周期及发酵终点时φ(乙醇)和ρ(葡萄糖)进行了对比分析，酸性蛋白酶对乙醇发酵周期的影响见表2， 酸性蛋白酶对发酵终点时φ(乙醇)的影响见表3，酸性蛋白酶对发酵终点时ρ(葡萄糖)的影响见表4。

表2 添加酸性蛋白酶对乙醇发酵周期的影响1)

由表2可知，随着w(糖化醪干物)的增大，空白实验和添加酸性蛋白酶实验的发酵周期均明显增长；当w(糖化醪干物)相同时，添加酸性蛋白酶实验的发酵周期均较空白实验明显缩短；随着w(糖化醪干物)的增大，添加酸性蛋白酶实验较空白实验的发酵周期缩短值明显增大，表明添加酸性蛋白酶更适合于乙醇浓醪发酵，作用效果尤为显著，为浓醪发酵所不可缺少。

表3 酸性蛋白酶对发酵终点时φ(乙醇)的影响1)

表4 酸性蛋白酶对发酵终点时ρ(葡萄糖)的影响

由表3、表4可知，当w(糖化醪干物)=27%～33%时，较空白实验，添加酸性蛋白酶可提高发酵成熟醪中φ(乙醇)=0.1%～0.5%，降低ρ(葡萄糖)=0.02～0.50 g/L；w(糖化醪干物)=35%，发酵成熟醪中φ(乙醇)较空白实验提高0.7%，ρ(葡萄糖)降低19.5 g/L，此时的φ(乙醇)与w(糖化醪干物)=33%相同，经济性较差，因此选择w(糖化醪干物)=33%较佳。

2.5 酸性蛋白酶添加量的优化

在w(糖化醪干物)=33%，酸性蛋白酶添加量为0～0.18 kg/t干物的条件下进行乙醇发酵实验，发酵液中φ(乙醇)随时间的变化见图7，ρ(葡萄糖)随时间的变化见图8。

酸性蛋白酶添加量/(kg·t-1干物)图7 φ(乙醇)随时间的变化

酸性蛋白酶添加量/(kg·t-1干物)图8 ρ(葡萄糖)随时间的变化

由图7、图8可知，发酵24～36 h，随着酸性蛋白酶添加量的增加，发酵液中φ(乙醇)逐渐上升，当酸性蛋白酶添加量大于0.09 kg/t干物时，发酵液中φ(乙醇)增长缓慢；发酵48～72 h，当酸性蛋白酶添加量为0.09 kg/t干物时，发酵液中φ(乙醇)达到最大值14.6%，继续增大酸性蛋白酶添加量φ(乙醇)不再上升，因此酸性蛋白酶的适宜添加量为0.09 kg/t干物。

3 结 论

发酵成熟醪φ(乙醇)并不随w(糖化醪干物)和酸性蛋白酶添加量的增加而增大，酸性蛋白酶更适合于乙醇浓醪发酵。优化的玉米浓醪发酵工艺为酸性蛋白酶添加量0.09 kg/t干物，w(糖化醪干物)=33%，糖化醪初始pH值(自然)无需调整，在以上条件下，发酵成熟醪中φ(乙醇)可达14.6%，发酵周期缩短24 h。