肉牛病毒性腹泻/黏膜病继发产气荚膜梭菌感染的诊断与处置

党如意，毕友坤,王 斌，叶 超，张 娜，杨增岐

(西北农林科技大学动物医学院，陕西 杨凌 712100)

2018年5月份西北部甘肃省某肉牛场发生疫情，短时间内有20余头牛发病，其中有11头发生猝死。病发前1个多月，该肉牛场先后从甲、乙两地购回2批共20余头7～10月龄的小牛，2批牛间隔半月时间。2018年5月初，先是从乙地购回的牛发病，后波及甲地牛和本场牛，前后不到1个月时间，牛陆续发病达27头，死亡11头，病死率达40%以上。结合临床症状和剖检结果，怀疑为牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)感染，为确诊疫情，结合临床症状和实验室诊断等，最终确诊为牛病毒性腹泻/黏膜病继发产气荚膜梭菌感染。

1 材料与方法

1.1 检测样品和实验动物 无菌采集该养殖场病死牛的心脏、脾脏、肺脏、肠组织以及肠道黏膜刮取物各2份(编号分别为1和2)，其中1份用于总RNA提取，-80 ℃保存；1份用于细菌分离培养鉴定；昆白系小鼠,购自中国人民解放军空军军医大学；W0841 BVDV阳性毒株,购自中国兽医药品监察所。

1.2 主要试剂 TRIzol试剂，购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa公司)；RT-PCR反转试剂盒以及PCR Mix，购自GenStar康润生物公司；药敏纸片，购自杭州滨和微生物试剂有限公司；其他试剂为国产分析纯。

1.3 引物 利用Primer5.0软件设计BVDV鉴定引物，预计扩增产物长度为218 bp，设计好的引物由西安擎科泽西生物科技有限责任公司合成。

1.4 方法

1.4.1 牛病毒性腹泻病毒PCR检测 用无菌的剪刀和镊子分别采取送检材料肺脏和肠道黏膜刮取物各2.0 g于组织研磨器中，充分研磨后，加入10 mL PBS混匀，以3 000 r/min离心5 min后，取1.0 mL上清液于1.5 mL无菌管中，2份样品分别编号为1和2，备用。TRIzol法提取病毒总RNA，使用GenStar反转试剂盒进行反转录，以产物为模板进行PCR扩增。

1.4.2 细菌学诊断 无菌操作取病死牛心、肝、肺及肠等病料，分别接种血平板，37 ℃进行有氧和厌氧培养 24 h。离心管收集病牛肠及内容物，于80 ℃水 浴10 min，离心，取上清液接入肉肝汤中，37 ℃ 厌氧培养24 h。培养物进行革兰染色。取肉肝汤培养物继续接种血平板，厌氧培养36 h。

1.4.3 动物接种试验 取100 μL上述培养物腹腔注射3只昆白系小鼠，以生理盐水作为对照。观察小鼠状态，如有死亡对其进行剖检。

1.4.4 药物敏感性试验 采用药敏纸片琼脂扩散法对分离菌进行18种抗生素的药敏试验。

2 结果

2.1 临床诊断 病牛体温升高，精神沉郁，口鼻、唇齿等黏膜充血、出血、溃疡，流涎，出现腹泻，粪便呈水样、恶臭。重症牛结膜发绀，濒死期很短，仅3～5 min，蹬腿挣扎。

2.2 PCR检测 PCR扩增结果如图1，片段大小为218 bp，测序结果序列和NCBI中登录的BVDV序列比对，二者同源性为100%。

图1 PCR扩增结果M：DL-2 000 DNA Marker;1：阳性对照;2：阴性对照;3、4：病料样品

2.3 细菌学诊断 厌氧培养18 h后，肉肝汤呈现浑浊状，有气泡。培养物进行革兰染色发现散在或成对的革兰阳性大杆菌。培养物接种血平板，厌氧培养36 h，血平板上长出1～3 mm大小、表面光滑并呈半透明状的圆屋顶样菌落，周围有溶血环。25 ℃放置1 h左右，溶血环外围的红细胞变为浅绿色。革兰染色镜检为散在或成对的革兰阳性大杆菌，两端略微钝圆，基本无链状排列。将其纯化接到牛乳中厌氧培养6 h后，牛乳爆裂。取血平板上的菌落进行α毒素检测，利用16S rRNA通用引物进行PCR扩增，将产物进行测序分析，确定为产气荚膜梭菌。

2.4 小鼠接种试验 腹腔接种 4 h后小鼠死亡。对死亡小鼠进行剖检发现心、肺病变不明显，肝脏充血、色暗红、易碎，脾脏充血，肾脏充血、质地软，胃壁变薄、内有气体，肠充气、壁薄有出血，十二指肠变红色。将小鼠肝、肠、脾、肾进行染色镜检，均可见散在或成对的革兰阳性大杆菌，两端略微钝圆。

2.5 药敏试验 按照美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)标准进行判定，药敏试验结果如表1。

表1 分离菌药敏试验结果

3 讨论

牛病毒性腹泻/黏膜病(BVD-MD)，是由牛病毒性腹泻病毒(BVDV)引起牛、羊和猪等动物的一种接触传染性疾病[1]。BVD-MD发生后，牛抵抗力下降，肠道菌群紊乱，极易诱发外源或条件性致病原感染，加剧病情和死亡。产气荚膜梭菌，属典型的条件致病菌，革兰染色阳性，菌体两端钝圆，能形成芽孢[2]。当牛从污染的环境中摄取其菌体或芽孢，或由其他因素导致牛的胃肠道内环境破坏、肠道菌群失调、免疫力下降时，菌体便可侵袭繁殖并产生大量毒素，使牛发病。

鉴于牛病毒性腹泻继发产气荚膜梭菌在牛场的发病率和致死率都很高，对该病的防治提出建议，为类似病例诊断和治疗提供参考。首先对有临床表现的牛进行隔离，以对症治疗、解毒保肝为原则，结合药敏试验结果，对发病牛给以抗病毒及抗梭菌类药物，如病毒唑、黄芪多糖、环丙沙星或庆大霉素，辅以中成药解毒剂、肝泰乐等。病情严重者，配合葡萄糖溶液静脉注射，并适量给予碳酸氢钠、维生素C和维生素K3等[3-4]。彻底清理厩舍内所有病牛排泄物以及被污染的垫料、食槽、用具等，并进行消毒，圈舍外及舍内过道全部撒以生石灰或漂白粉。暂停青贮饲料喂牛，对隔离牛给以优质青粗饲料。选用质量可靠的牛病毒性腹泻/黏膜病灭活苗、弱毒苗[5]，以减少发病造成的损失。

发病牛场采取上述处理措施后，再未出现新的病例。而且被隔离的病牛经治疗全部恢复。牛病毒性腹泻/黏膜病在该省牛群中普遍存在，隐性感染情况严重[6]。该牛场此次发病，源于其外购牛回场前未做检疫，并直接与本场其他牛进行混群饲养，从而导致病毒性腹泻/黏膜病的发生和传播。发病牛因消化道受损，导致消化机能紊乱、肠道微生物菌群平衡失调、免疫力和抵抗力下降，产气荚膜梭菌伺机感染并产生毒素，两病合力，加之处置不及时，从而造成部分牛死亡的严重损失。此事件进一步提醒广大养殖者，引种或者外购动物，必须加强隔离检疫，防止牛源生物制品的BVDV污染[7]，以免造成不必要的损失。以养牛业为主的地区，可根据养殖情况、牛病毒性腹泻/黏膜病血清抗体监测情况等，制定切实可行的控制或根除计划，以达到本病的地区净化。