泡囊短波单胞菌对鲫鱼的病理组织学损伤

张 桦，王 利，李 娟，傅 芳

(1.西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041；2.西南民族大学青藏高原研究院，四川 成都 610041)

泡囊短波单胞菌(Brevundimonasvesicularis)是一种较罕见的非发酵性病原性假单胞菌，按照新版伯杰手册，根据RNA同源性分类为假单胞菌科rRNA同源群4，为微小假单胞菌DNA同源群泡囊短波单胞菌[1]。该菌被认为有机会成为全球新型的机会致病菌，在宫颈炎、皮肤病、泌尿道疾病、血流感染、胸腔、心包腔及中枢神经系统等感染中均有发现[2-6]。在2010年，Popowska M等[7]发现土壤中存在着对四环素具有较高抗性的泡囊短波单胞菌。近年来，对泡囊短波单胞菌的研究主要集中在人类疾病上[8-11]，而在水生动物中仅有1例基于泡囊短波单胞菌对兰·坎皮海龟的IgY滴度产生影响的研究[12]。

鲫鱼(Carassiusauratus)是一种杂食性的淡水鱼，为辐鳍鱼纲鲤形目鲤科鲫属的一种鱼类[13-14]。由于鲫鱼大规模养殖，且随着养殖密度的不断扩大，越来越多的疾病在鱼身上暴发。其中细菌性疾病是最为严重的传染性疾病，许多文献报道的鱼类细菌性病原主要包括普通变形杆菌、嗜水气单胞菌和鲁氏耶尔森氏菌等[15]；对鱼类病理组织观察也只是在细菌性败血症、嗜水气单胞菌感染[16]。本试验是以患病的黄颡鱼中分离得到泡囊短波单胞菌菌株，人工感染鲫鱼，探讨其对鲫鱼的病理组织学损伤，为鱼类泡囊短波单胞菌的感染防控提供科学资料。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)试验菌株:于西南民族大学武侯校区第二实验楼水族箱的患病黄颡鱼中分离出的1株菌，命名为Z1，经鉴定为泡囊短波单胞菌，保存于-80 ℃ 超低温冰箱中备用。(2)试验动物:从成都某养殖场购置的健康鲫鱼20尾，饲养于西南民族大学武侯校区第二实验楼。鲫鱼的体长(20±5)cm，体重为(250±5)g。眼观体表完整、健康良好。(3)试验试剂:LB培养基、琼脂粉、多聚甲醛、甘油，购自成都市科龙化工试剂厂；二甲苯，购自天津市致远化学试剂有限公司；无水乙醇，购自成都海兴化工试剂厂；苏木素染液、伊红染液(醇溶)、中性树胶，均购自合肥新恩源生物技术有限公司；1.1×T3 Super PCR Mix，购自北京天根生化科技有限公司；16S rDNA引物合成于生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株悬浮液的制备 取保种的泡囊短波单胞菌Z1 100 μL接种于10 mL的LB液体培养基中，37 ℃，120 r/min培养12 h，于分光光度计中测定其OD600值。将测定的吸光度带入其活菌数的OD600值标准曲线，得到菌液浓度。最后用0.85%的生理盐水将菌液浓度调至5.0×107CFU/mL[17]。

1.2.2 动物试验 试验鲫鱼在实验室暂养1周，将其随机分成对照组和试验组，每组各10尾，饲养条件一致。在饲养期间均给鲫鱼的正常生长条件，每天定时投喂饲料，3 d换水1次。参照1.2.1配制成的5.0×107CFU/mL的菌液，试验组每尾给予0.2 mL的菌液腹腔注射，对照组给予同等体积的0.85%生理盐水腹腔注射。观察鲫鱼的临床症状并做好相关试验记录。

1.2.3 病理切片的制作 观察鲫鱼的精神状况、食欲状态、活动情况、死亡情况。对感染发病鱼进行组织病理学观察，即取感染发病鱼的脾脏、心脏、肾脏、肝脏、肌肉，先固定于4%的多聚甲醛溶液中24 h以上，再分别于50%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ脱水1 h，随后在二甲苯与无水乙醇的1∶1混合溶液中透明15 min，再在二甲苯中透明20 min，最后浸蜡、包埋、切片和H.E.染色。试验期间做好临床症状、剖检症状、病理组织症状的记录。

1.2.4 细菌的分离鉴定 在无菌环境下，用接种环分别穿刺试验组感染发病鱼的脾脏、肝脏、肾、心脏和腹腔积液，划线于LB固体培养基，于37 ℃恒温培养箱中培养12 h。之后对平板里的菌按照常规操作进行分离和纯化，挑取形状、颜色、大小相近的单菌落并命名为Z2，于LB液体培养基中37 ℃，180 r/min 培养12 h。运用16S rDNA通用引物对分离到的Z2菌进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，有目的条带，然后送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

2 结果

2.1 临床症状 在感染24 h后，试验组鲫鱼开始出现精神不佳、活动能力减弱、食欲减退、体表黏液增多、皮肤泛黄、局部出血、肛门红肿、鱼鳍基部有出血点、烂尾、鱼鳞脱落、腹部肿胀、体表充血等临床症状(见中插彩版图1)。48 h后，感染鱼开始出现死亡。对照组无病理变化现象。

2.2 剖检症状 对发病鱼进行剖检，眼观均表现为皮下局部肌肉呈弥散性出血，腹部有大量积液；肝、胰脏颜色变深、肿大并伴有树枝状出血现象；肾脏易发生溶解且肾体积肿胀并伴随有充血现象；脾脏肿大，颜色变深、变暗(见中插彩版图2)。

2.3 病理组织学观察 经光学显微镜观察，受感染鲫鱼的肝脏、脾脏、肾脏、肌肉、心脏均呈现出不同的病变情况，组织或者细胞基本都发生肿胀、充血、变性、坏死等主要病理变化(见中插彩版图3)。肝脏经光学显微镜观察可知：肝细胞发生水肿变性且失去原有的细胞形态，细胞核体积增大并且部分细胞核被挤压到细胞的一侧，细胞质可见大小不一的空泡，肝血窦扩张充血，肝组织中有少量炎性细胞浸润(见中插彩版图3A)。脾脏经光学显微镜观察可知：脾脏组织结构疏松，淋巴细胞数量相对减少，红细胞数量相对增多且几乎覆盖整个脾脏组织。脾脏组织中还可见含铁血黄素的沉积，提示脾脏有溶血现象。脾窦扩张出血，脾白髓的淋巴细胞变性(见中插彩版图3B)。肾脏经光学显微镜观察可知：肾脏组织中炎性细胞浸润，肾小管上皮细胞肿胀并伴随有玻璃样变性，细胞核体积增大，从组织切片中还可以看出肾小管上皮细胞有脱落现象。肾小球中充满红细胞，肾小管间质增厚，并有大量的红细胞充盈期中，即发生了毛细血管闭锁的现象。肾小管的管腔变狭窄，并有些肾小管的管腔中充斥着透明管型(见中插彩版图3C)。心脏经光学显微镜观察可知：心肌细胞肿胀，细胞核浓缩，出现透明变性，细胞间隙变宽，心肌纤维呈不规则波浪状条纹并且部分心肌纤维发生断裂(见中插彩版图3D)。肌肉组织经光学显微镜观察可知：肌细胞间隙增大且有红细胞出现，肌纤维有断裂现象且排列紊乱(见中插彩版图3E)。

2.4 细菌的鉴定 分离的Z2菌16S rDNA基因扩增结果见图4，测序所得基因的片段长度为1 375 bp。经NCBI的BLAST比对之后发现其与泡囊短波单胞菌266XY4株的一致性最高，为98%，该菌为泡囊短波单胞菌，与注射菌株一致，从而判断该菌株可引起鲫鱼致病。

图4 保种菌和分离菌的基因扩增产物Fig.4 Gene amplification products of preserved and isolated bacteriaM：DL-2 000 DNA Marker；1：泡囊短波单胞菌菌株Z1；2：感染鱼中分离菌株Z2M:DL-2 000 DNA Marker;1:Brevundimonas vesicularis strain Z1;2:Strain Z2 isolated from infected fish

3 讨论

泡囊短波单胞菌又名泡囊假单胞菌，是一种较罕见的非发酵性病原性假单胞菌。1994年，Segers等[18]将其划归于短波单胞菌属。2018年，Ryan M P等[2]将其描述为一种新出现的全球条件致病菌。目前国内外学者对泡囊短波单胞菌的研究主要集中在人体临床感染等方面，2001年，于爱民等[19]从新生儿患者血标本中分离到1株泡囊短波单胞菌，发现其能致败血症并伴有抽搐、青紫等临床现象。2003年，魏丽等[20]首次从临床患者的尿液中分离出1株泡囊短波单胞菌，发现其能致尿路感染并伴有发热、尿频、尿急、尿不尽等临床症状。2007年，马学斌等[21]发现泡囊短波单胞菌能致关节腔感染并导致其肿大。2018年，Christiadi D等[8]报道了由泡囊短波单胞菌引起腹膜炎的治疗。泡囊短波单胞菌的致病性通常发生于自身免疫系统发育不完善、免疫力低下、大量应用广谱抗菌药物、皮质激素以及免疫抑制治疗后的人群。本试验将该菌通过腹腔注射至鲫鱼腹腔组织，通过血液循环感染各组织，导致各组织出现变性、肿胀、出血等现象。由此分析鲫鱼快速死亡的原因可能有以下3点：(1)鲫鱼受到内外环境变化的刺激以及受到致病菌的感染，导致体内内环境稳态失衡，免疫力下降；(2)鲫鱼受到致病菌的感染，导致体表出血、溃烂，从而增大鲫鱼被其他一些致病菌感染的机会；(3)鲫鱼受到致病菌的感染，导致鲫鱼的各组织出现病理损害。这表明该菌对鲫鱼有致病性。

本试验中，发病鲫鱼的临床症状与患病的黄颡鱼的临床症状相似，如鱼鳍基部有充血、出血、红肿、溃烂现象，皮肤有出血点、肛门有红肿、腹部肿大等，这与任思宇等[22]的1例鲫鱼细菌性败血症的病原学和病理学研究相似。通过光学显微镜观察鲫鱼各组织病理切片，发现受感染鲫鱼的心脏、肾脏、脾脏、肝脏和肌肉都有不同程度的损坏。心脏心肌纤维排列紊乱，心肌细胞间隙增大。肾脏的肾小管上皮细胞肿胀、脱落、变性、出血、炎性细胞浸润，这与申会刚等[23]的鲫鱼嗜水气单胞菌感染后脾、肾、肝的组织学病变及吞噬细胞的变化相似。脾脏的红细胞数量增多，含铁血黄素的沉积，这与赵静等[16]黄颡鱼感染小肠结肠炎耶尔森菌的脾脏病变有所区别。肝脏组织结构疏松，出血，肝细胞肿胀变性，这与曾燕玲等[14]鲫鱼感染嗜水气单胞菌的症状相似,与蒋自立等[15]嗜水气单胞菌感染黄颡鱼肝组织病变有所区别。肌肉组织的肌纤维排列紊乱，间隙增大。

综上所述，本文探讨了泡囊短波单胞菌对鲫鱼各组织器官的病理性损伤，这将有利于为鱼类泡囊短波单胞菌的感染防治提供科学参考。