Axin1、Gsk-3β和CD82在皮肤鳞状细胞癌中的表达

朝鲁门 张士发

1锦州医科大学北部战区总医院研究生培养基地，辽宁沈阳，110016；2北部战区总医院皮肤科，沈阳，110016

皮肤鳞状细胞癌(cSCC)是起源于表皮或附属器角质形成细胞的恶性肿瘤。大多数cSCC发生在老年患者的光暴露部位，在日光性角化病(actinic keratosis，AK)基础上发病。国内研究发现，cSCC的发病率约为29.4%，已超过基底细胞癌(basal cell carcinoma，BCC)成为发病率第一位的非黑素瘤皮肤癌(non-melanoma skin cancer，NMSC)[1]。随着我国人口老龄化的发展和皮肤恶性肿瘤病理活检患者的数量增多，cSCC的确诊病例数亦逐年上升。除紫外线辐射外，其他危险因素还包括慢性免疫抑制状态(如人类免疫缺陷病毒感染)、慢性皮肤病、人乳头瘤病毒感染等。cSCC早期即可发生转移，这不仅可增加患者负担，也对后续的治疗造成巨大挑战。

然而，cSCC发生的分子机制尚不完善。有研究表明，Wnt信号通路参与了cSCC的发生和发展[2]。Wnt通路在细胞分化、增殖、凋亡等过程中发挥重要作用，它由一系列信号传导蛋白组成，成员包括轴抑制蛋白(axis inhibitor factor 1，Axin1)、糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase 3β，Gsk-3β)和腺瘤性息肉病肿瘤抑制基因(adenomatous polyposis coli，APC)等。分化簇82(cluster of differentiation 82，CD82)是Tetraspanin糖蛋白超家族的成员，是一种肿瘤转移抑制基因。最近有研究发现，CD82可通过下调细胞膜上的Wnt受体来抑制Wnt信号通路。本文研究了Axin1、Gsk-3β和CD82在CSCC中的表达，探讨其在CSCC中的作用。

1 资料与方法

1.1 病例资料 实验组取自2008年1～12月于北部战区总医院沈河院区皮肤科就诊的40例临床资料完整的cSCC患者术后组织石蜡块，对照组取自15例同期于本科室就诊的良性皮肤病患者的皮肤组织。根据 Broders[3]分级法将cSCC分为I～IV级，其中I级15例(37.5%),II级15例 (37.5%),III级10例(25%),未见IV级。术前均未进行放、化疗，既往史及过敏史无特殊。

1.2 免疫组化步骤 兔抗人Axin1单抗、Gsk-3β单抗、CD82单抗,免疫组化试剂盒均购自北京博奥森生物技术有限公司。免疫组化步骤严格按照试剂盒说明书进行。用PBS代替一抗作空白对照。

1.3 结果判断 由两位病理医师在不知临床资料的情况下对免疫组化结果进行评估，在显微镜下，每张切片随机选择5个视野，在15×20高倍镜下观察计数100个瘤细胞，镜下表现为在细胞质内或沿细胞膜呈黄色或棕色颗粒状沉积视为阳性表达。无阳性细胞计0分，≤10%计1分，11%～50%计2分，51%～75%计3分，>75%计4分。细胞染色与背景无异计0分，染色为淡黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分。免疫组化评分=阳性细胞百分比积分×细胞染色强度积分。免疫组化评分>3分为免疫反应(+)[4]。

1.4 统计学方法 用SPSS 24.0统计学软件进行统计学处理，率比较采用卡方检验与Fisher确切概率法，相关性分析采用Spearman秩相关分析，P<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 Axin1、Gsk-3β和CD82在cSCC及正常皮肤组织中的表达 Axin1、Gsk-3β和CD82阳性信号大部分定位于细胞质内，少数定位于细胞膜或细胞核。Axin1在cSCC和正常皮肤组织中的阳性表达率分别为42.5%、86.7%，Gsk-3β在cSCC和正常皮肤组织中的阳性表达率分别为40.0%、80.0%，CD82在cSCC和正常皮肤组织中的阳性表达率分别为35.0%、73.3%，Axin1、Gsk-3β和CD82在cSCC中的阳性表达率显著低于正常皮肤组织，P值分别为0.003、0.008、0.011，差异具有统计学意义。Axin1、Gsk-3β和CD82在cSCC组织的阳性表达率与正常组织相比显著降低。见表1和图1。

2.2 Axin1、Gsk-3β和CD82与cSCC患者各病理学特征间的关系 Axin1在cSCC I级、II级、III级的阳性表达率分别为66.7%、40.0%、10.0%，Gsk-3β在cSCC I级、II级、III级的阳性表达率分别为73.3%、20.0%、20.0%，CD82在cSCC I级、II级、III级的阳性表达率分别为60.0%、26.7%、10.0%，Axin1、Gsk-3β和CD82在cSCC中的阳性表达率III级

1a:Axin1主要分布于癌细胞胞质中，少数表达于胞膜，积分为4；1b:Gsk-3β在肿瘤细胞中染色浅，积分为2；1c：CD82在癌组织中染色浅，表达少，积分为1;1d:Axin1在表皮全层呈强阳性表达，阳性染色主要定位于胞膜，积分为12；1e: Gsk-3β在基底层以上角质形成细胞中广泛分布，积分为6；1f:CD82在基底层以上角质形成细胞中广泛分布，积分为6

表2 Axin1、Gsk-3β和CD82与cSCC患者各病理学特征间的关系

2a: Axin1广泛分布于癌细胞胞质中，积分为9；2b: Axin1分布于癌细胞胞质中，少数沿细胞膜分布，积分为6；2c:癌细胞散在染色，积分为3；2d: Gsk-3β均匀分布于癌巢，积分为6；2e: Gsk-3β均匀分布于癌巢中，积分为3；2f:肿瘤细胞未染色，积分为0；2g: CD82广泛表达于癌巢中，积分为6；2h: CD82散在分布于癌巢，积分为2；2i: CD82在肿瘤细胞中散在染色，积分为1

2.3 Axin1、Gsk-3β和CD82在cSCC组织中表达的相关性 Axin1、Gsk-3β在cSCC中呈正相关表达(r=0.677，P<0.05)；Axin1和CD82在cSCC中的表达无相关性(P=0.596)；Gsk-3β和CD82在cSCC中的表达无相关性(P=0.671)。见表3、4、5。

表3 Axin1与Gsk-3β在cSCC组织的相关性

表4 Axin1与CD82在cSCC组织的相关性

表5 Gsk-3β与CD82在cSCC组织的相关性

3 讨论

Wnt信号传导通路是皮肤发育的基础，持续的Wnt信号能阻断鸡胚表皮母细胞对成纤维细胞生长因子(FGFs)的反应，促进骨形态发生蛋白(BMP)的表达，诱导新生皮肤上皮中角蛋白的产生，从而形成表皮。相反，若表皮细胞缺乏对Wnt信号的暴露，则促进FGFs信号传导，形成神经系统[5]。

Wnt通路主要通过调节胞质内的β-catenin发挥生物学功能。无Wnt信号时，Axin1作为支架蛋白与Gsk-3β和APC结合形成降解复合物，从而降解胞质中的β-连环蛋白(β-catenin)，使其保持一定的浓度。当Wnt配体通过与细胞膜上的七跨膜受体Frizzled(FZD)和LRP5/6共受体结合激活该通路时，可导致细胞内Dishevelled(DVL)的募集。DVL拮抗降解复合物的活性使β-catenin在细胞质内聚积，然后发生核转位，在T细胞因子/淋巴增强因子转录因子(TCF/LEF)的作用下，β-catenin引起Wnt靶基因转录[6]。此外，被Gsk-3β磷酸化的Axin1能够增加它自身的稳定性，而未被磷酸化的Axin1对β-catenin的亲和力较低，因此会降低它促进β-catenin降解复合物形成的能力。研究发现，CD82可通过多种机制抑制Wnt信号通路。一是可以抑制β-catenin酪氨酸磷酸化，稳定细胞膜上的E-钙黏连蛋白(E-cadherin)-β-catenin复合物，阻止癌细胞从原发癌巢中解离，从而限制癌细胞转移。二是可通过下调FZD来抑制信号传导。三是通过下调Gsk-3β和激酶酪蛋白激酶1α(CK1α)，抑制β-catenin在Ser45、Ser33、Ser37和Thr41的磷酸化[7]。

Axin1参与细胞生长、增殖、分化、癌变和凋亡等多种调控过程[8]。既往关于鳞癌的国内外研究发现，在食管鳞癌[9]、非小细胞肺癌[10]等组织中Axin1的表达降低与不良肿瘤分化、淋巴结转移等呈负相关。在皮肤病方面，梁俊琴等[11]发现，Axin1 mRNA在cSCC中的表达低于正常皮肤组织，且其在cSCC中的低表达与病理分级无关。本实验发现，Axin1在cSCC中的阳性表达率显著低于正常皮肤组织，分别为42.5%、86.7%，提示其表达降低可能与cSCC发病有关，随着病理分级升高，其表达率逐级降低，这说明表达强度可能与肿瘤进展有关，与既往研究结果基本符合。

Gsk-3β是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，研究发现其在糖尿病、阿尔兹海默症和免疫疾病等的发生、发展中发挥重要作用。在皮肤病方面，Ma等[12]发现Gsk-3β在cSCC中的表达显著低于邻近的非肿瘤角质形成细胞,说明Gsk-3β的下调或失活对表皮细胞是致癌的。然而，Ahn等[13]发现宫颈鳞癌中Gsk-3β的表达高于正常宫颈组织，提示Gsk-3β促进了宫颈鳞癌的发生和发展。本实验发现，与正常皮肤组织相比，Gsk-3β在cSCC中的表达率显著降低，分别为80.0%、40.0%，这与MA等研究者的结果一致。Gsk-3β在肿瘤中的作用受其磷酸化形式、组织中表达位置和肿瘤类型的影响，在不同肿瘤中可介导完全相反的肿瘤结局。

KAI1/CD82是Dong等[14]发现的位于染色体11p11.2上的肿瘤转移抑制基因。CD82可抑制多种肿瘤的转移，与肿瘤的侵袭和预后密切相关。在多种器官鳞癌(口腔鳞癌[15]、阴茎鳞癌[16]、喉鳞癌[17]和宫颈癌[18])中，均报道了CD82的低表达与肿瘤的发生有关。另外，在食管鳞癌中CD82的表达与病理分级、远处转移和预后不良有关[19]。在皮肤病中，CD82在增生性痣、原发性黑素瘤和转移性黑素瘤中的表达逐渐降低[20]。本研究发现，与正常皮肤组织相比，CD82在cSCC中的表达率显著降低，分别为73.3%、35.0%，提示其表达降低可能与cSCC发病有关，随着病理分级升高，其表达率逐级降低，这说明表达强度可能与肿瘤进展有关，与以往研究结果一致。

在乳腺癌中，胞浆中Axin保留的表达(≥40%肿瘤细胞呈阳性染色)与Gsk-3β呈正相关[21]。陈靖等[22]研究Axin、Gsk-3β在食管癌中的作用时也发现，食管鳞癌中Axin与Gsk-3β的表达呈正相关，从而证实了Axin、Gsk-3β在β-catenin降解复合物中的功能结合，需两者协同作用方能有效地将β-catenin磷酸化。

△Np63a上调CD82以抑制细胞侵袭，Gsk-3β可能通过调节△Np63a-CD82轴来调节细胞侵袭。CD82是△Np63a(不含N-末端反式激活结构域的P63蛋白亚型)的直接转录靶点，后者是在上皮细胞和鳞状细胞癌中表达的主要异构体。△Np63a的表达抑制了Matrigel细胞的生长和癌细胞的侵袭，在很大程度上可被CD82的特异性消融所逆转。相反，敲除△Np63a基因可增加细胞侵袭，而CD82的异位表达可逆转这一过程。此外，用药物或RNA抑制Gsk-3β活性可导致△Np63a和CD82表达下调，细胞侵袭力增加[23]。在cSCC中，未发现CD82与Wnt负调节因子Axin1和Gsk-3β表达的相关性，因此，Wnt通路可能不经过CD82促进发病，这可能与组织特异性，且cSCC大多发生在AK的皮损上有关。

Axin1在cSCC中的低表达提示Axin1在cSCC的发生、发展过程中起一定的作用，可为cSCC的早期诊断和治疗提供参考。Gsk-3β在细胞凋亡、细胞周期、DNA修复、肿瘤生长和癌症免疫等许多生物学过程中均发挥作用，因此靶向Gsk-3β将是一种合理的放射、化疗和免疫相结合治疗癌症的策略。CD82单抗(CD82-mAb)也被证明在急性髓系白血病(AML)小鼠模型中，可将骨髓中的CD34+白血病细胞转移到外周血中，且CD82-mAb与阿糖胞苷(AraC)联合应用比单独使用AraC或CD82-mAb治疗延长了携带人类AML细胞的免疫缺陷小鼠的生存期。

本研究证明Wnt信号通路在cSCC中有促进作用，但详细的分子信号传递过程仍需下一步的实验进行验证。本组病例中无淋巴结转移患者，因此未能研究三种蛋白在转移的淋巴结或远隔组织中的表达情况。下一步的实验需纳入晚期患者，检测β-catenin及下游信号物质，应用Western Blot技术进行定量分析，CCK8实验检测细胞增殖和Transwell实验检测细胞侵袭。晚期cSCC预后差，因此明确所涉及的分子途径对于开发新的治疗方法非常重要，本研究也为cSCC的诊断及治疗提供部分理论基础。