龙胆泻肝汤激活Bax/Caspase-3通路并诱导人角质形成细胞凋亡

杨冠群 郭 春 魏海峰 周 煜 周曙杰 梁晨希 吴国境 许博涵 邹永新 张晓杰 孙淑娜

1山东大学齐鲁医学院基础医学院遗传学系，山东济南，250012； 2山东中医药大学，山东济南，250355；3山东中医药大学附属医院皮肤科，山东济南，250011

龙胆泻肝汤由龙胆草、栀子、黄芩、木通、泽泻等十味中草药配制而成[1]，是一种具备清肝利胆，泻实火清湿热之效用的清热药剂[2]。近年来,龙胆泻肝汤已广泛应用于中医临床皮肤科,并对银屑病症状的改善有良好的效果[3]，但作用靶点和分子机制还未被了解，细胞和分子水平的作用效果也尚未得到验证。银屑病患者皮损处的表皮角质形成细胞异常增殖是其最显著的病理特征之一[4]，本研究利用人永生化角质形成细胞分析了龙胆泻肝汤对银屑病皮损处角质形成细胞凋亡的影响以及机制，为解释龙胆泻肝汤治疗银屑病的临床作用机制提供可靠的理论依据和实验数据。

1 实验材料

1.1 细胞株 人永生化角质形成细胞：武汉大学保藏中心 (china center for type culture collection， CCTCC)， 资源编号3142C0001000001712。

1.2 主要试剂 细胞培养用胰蛋白酶、DMEM培养基和胎牛血清：美国Gibco生命技术公司；RIPA裂解液，Tunel凋亡染色试剂盒：上海碧云天公司；DAPI：西格玛公司；Trizol RNA提取裂解液：美国英杰生命技术有限公司；Western blot用一抗：美国圣克鲁斯生物技术公司；Western blot用辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗：北京ZSGB-Gio公司；Western blot ECL化学发光法检测试剂盒：碧云天生物技术有限公司；Caspase-3抑制剂Z-DEVD-FMK：MedChem Express公司；PCR引物：上海Sangon Biotech公司；LightCycler 480 SYBR Green I Master：瑞士ROCHE公司；cDNA反转录试剂盒：天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 药品 龙胆泻肝汤药液：龙胆草12 g、山栀18 g、泽泻24 g、黄芩18 g、柴胡20 g、生地黄40 g、车前子18 g、当归16 g、甘草12 g。将上述中药浓缩成2 mL相当于3 g原中药材的药液，在超净台内过滤除菌，于4℃冰箱保存备用。细胞培养时稀释到相应终浓度。

1.4 主要仪器 CO2培养箱(美国Thermo公司)、生物安全柜(美国Thermo公司)、倒置荧光显微镜(日本奥林巴斯株式会社)、荧光定量PCR仪(美国ABI公司)、蛋白垂直电泳系统(美国伯乐生命Bio-Rad产品有限公司)。

2 实验方法

2.1 细胞培养 用DMEM培养基(含10%胎牛血清)培养HaCaT细胞，每24 h换液。取状态较好的对数生长期HaCaT细胞进行实验。药物组，100 μg/mL药液的DMEM培养基培养72 h；对照组，含与药物组药物等体积去离子水的DMEM培养基同等条件下培养72 h。

2.2 Tunel法检测细胞凋亡 等体积不同药物浓度梯度的DMEM培养基同等条件下培养，设置药物浓度梯度为：0 μg/mL，20 μg/mL，40 μg/mL，80 μg/mL，100 μg/mL。参照Tunel染色试剂盒说明书严格操作，用含有DAPI(4’,6-二脒基-2-苯基吲哚)的抗荧光淬灭封片液封片后，在荧光显微镜下观察。每组细胞随机选择3个高倍镜(×200)视野，每个视野计数100个细胞，计算HaCaT细胞凋亡率。凋亡率=BrdU阳性细胞/100×100%。取3个视野的平均百分数作为结果，实验重复三次。

2.3 Western blot用RIPA裂解液冰上裂解提取药物处理组的HaCaT细胞总蛋白 用BCA蛋白标准曲线法进行蛋白质定量检测；取40 μg样品变性；SDS-PAGE电泳，转膜，在含5%脱脂奶粉的TBST封闭液中封闭(25℃，1 h)，一抗孵育(4℃，12 h)，TBST溶液洗膜三次，5 min/次，二抗孵育(37℃，1 h)，TBST溶液洗膜三次，5 min/次；ECL化学发光，显影定影，胶片曝光，结果使用扫描仪扫描保存。实验重复三次。

2.4 实时定量PCR 使用Trizol法裂解药物处理的HaCaT细胞提取RNA，并参照说明书进行逆转录。实时定量PCR检测，每个样品设4个复孔。反应体系：每10 μL反应体系包括去离子水4.2 μL、cDNA 0.5 μL、逆转录引物0.3 μL、Light Cycler 480 SYBR Green I Master试剂5 μL。反应条件：预变性94℃，3 min；变性95℃，30 s；退火60℃，30 s；延伸72℃，30 s。共40个循环。以GAPDH为内参，应用Roche Light Cycler 480自带分析程序比较不同样本同一目的基因的表达变化情况，并进行分析。引物序列见表1。实验重复三次。

表1 引物序列

2.5 统计学方法 用SPSS 22.0(Windows)统计软件处理上述实验数据，采用单因素方差分析，组间数据应用t检验分析评价。以P<0.05为有统计学差异。

3 结果

3.1 龙胆泻肝汤诱导HaCaT细胞凋亡 80 μg/mL龙胆泻肝汤处理72 h后，在倒置显微镜下观察，实验组与未使用药物处理的对照组相比，细胞的增殖受到明显抑制。具体表现为：可见原来贴壁生长的细胞逐渐脱落，细胞体积减小、形状变圆、折光性增强(图1a)；DAPI染色后在荧光镜下观察，明显可见细胞显现出典型的凋亡细胞状态(图1b)，细胞核裂解为大小不等的凋亡小体。

Tunel染色结果显示，龙胆泻肝汤处理72 h后的HaCaT细胞与未经处理的细胞凋亡比例相比，实验组的 HaCaT细胞Tunel阳性染色细胞比例明显上调，并且与龙胆泻肝汤处理浓度的增加呈正相关(图1c)，提示龙胆泻肝汤诱导凋亡的作用呈剂量依赖性增加。

1a:对照组和药物组倒置光学显微镜进行观察；1b:荧光显微镜下观察药物组细胞凋亡，白色箭头指示凋亡细胞；1c:Tunel检测凋亡实验。标尺，50 μm。与对照组比较，**：P<0.01；***：P<0.001

3.2 龙胆泻肝汤抑制Bcl-2的表达，促进Bax的表达 为了明确龙胆泻肝汤诱导HaCaT凋亡的作用机制，我们利用western blot分析了两组HaCaT细胞内调控细胞凋亡的关键基因Bcl-2和Bax表达量的变化，结果如图2所示：40 μg/mL龙胆泻肝汤处理72 h后细胞内抗凋亡蛋白Bcl-2的表达明显下降，同时促凋亡蛋白Bax的表达有明显上调(图2a)。实时定量PCR结果与检测到的蛋白水平的变化相一致，实验组细胞内Bcl-2的mRNA也有明显下降，而Bax的mRNA有明显上调(图2b)。

2a：western blot实验；2b：实时定量PCR *:P<0.05

3.3 龙胆泻肝汤通过激活caspase 3依赖的途径诱导细胞凋亡 caspase-3蛋白的激活在细胞凋亡过程中发挥关键作用，因此我们随后对caspase-3的蛋白水平进行了检测。结果显示40 μg/mL浓度的龙胆泻肝汤处理HaCaT细胞72 h后，无论是总蛋白水平还是活性caspase-3水平均有明显的增加。为了进一步明确结论，我们使用caspase-3特异性抑制剂Z-DEVD-FMK(终浓度50 μM)预处理细胞2 h后再加入40 μg/mL龙胆泻肝汤继续培养细胞72 h。Tunel染色结果显示， Z-DEVD-FMK可有效拯救药液诱导的细胞凋亡。这些结果提示龙胆泻肝汤可通过上调caspase-3诱导HaCaT细胞凋亡。

4 讨论

银屑病是一类临床上常见的皮肤病[5]。据统计，银屑病的全球平均发病率为2%～3%，在发达国家能达到4%～6%，而且多数银屑病患者年龄在40岁以下[6,7]。银屑病具有病程长、易复发的特点，很多患者终生不愈，生活质量严重下降，患者不仅遭受着身心的折磨，其家庭乃至整个社会也承受着沉重的负担[8]。相比目前常用的免疫抑制疗法，传统的中医在银屑病治疗时在改善病情的同时，还展现出缓解期长、不良反应小等独特优势。龙胆泻肝汤具备清肝利胆，泻实火清湿热之效用，是中医药领域经典的清热方剂[2]，临床上主要用于治疗肝胆实火、目赤头疼、口苦胁痛、耳聋耳肿、阴痒阴肿等症状[18]。近年来，龙胆泻肝汤在银屑病治疗中也表现出较好的疗效[2]，但其作用靶点和分子机制尚不清楚，细胞和分子水平的作用效果也尚未得到验证。

3a: western blot实验;3b: Caspase-3抑制剂逆转Tunel法凋亡实验，与对照组比较，**：P<0.01；***：P<0.001

角质形成细胞(keratinocyte, KC)可以通过发挥防御病原体、隔离紫外线、防止水分蒸发等多种重要作用，维持皮肤的正常结构和功能。KC增殖分化凋亡发生异常时可能会导致以银屑病为代表的多种角化性皮肤病或其他表皮肿瘤。银屑病皮损处存在明显的KC增殖分化异常，例如，不完全的KC分化和成熟缩短(角化不全)以及KC增厚(角化过度)导致表皮的高增殖和棘层的肥厚，这种变化的结局是KC的异常积聚，形成鳞状皮屑[7-9]。此外，细胞因子对银屑病病程的发展也发挥着不容忽视的作用。皮损处活化T细胞产生的TNF、INF-γ、IL-17和IL-22等细胞因子可以活化KC内NF-κB 和STAT3等信号通路，诱导KC异常增殖分化发挥作用。进一步研究证明KC也是产生细胞因子的重要细胞[8]，激活的KC又可以产生IL-1b,IL-6、IL-8、TNF-α、CXCL1、CXCL5、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CCL2、CCL5、CCL20、LL37等，趋化多种炎性细胞，从而使皮损处及皮损周围的炎症反应级联放大，形成一个恶性循环[7,8,10]。因此，抑制KC的过度增生对临床治疗银屑病有着重要的实践意义。紫外光疗，外用维A酸、维生素D类似物以及注射水合钙离子等临床疗法均是通过抑制KC增殖或诱导细胞凋亡实现其治疗目的[7]。

诱导细胞凋亡是治疗包括肿瘤在内多种细胞异常增生疾病的有效途径。在银屑病治疗中，诱导皮损处异常增殖KC凋亡也是缓解银屑病的有效方法之一[11]，如紫外线光疗。Bcl-2和Bax是调控细胞凋亡的两个经典“开关蛋白”。Bcl-2的激活和表达抑制细胞凋亡，而Bax在细胞内发挥着促凋亡作用[12,13]。上述的实验结果告诉我们龙胆泻肝汤对人HaCaT细胞起着明显的诱导凋亡的作用，而且这种诱导作用伴随着Bcl-2的显著下调和Bax的显著上调。鉴于Bcl-2和Bax在凋亡中的重要功能，这些结果提示龙胆泻肝汤可能通过调控Bcl家族成员的表达来实现对凋亡的诱导。

天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)家族级联反应最下游的蛋白酶caspase-3是凋亡过程的关键执行因子[14]，尤其当细胞出现染色质凝结和DNA裂解时[15,16]并且有研究证实Bcl-2和Bax以及caspase-3相互影响，共同调控细胞的凋亡进程[17]。我们的结果显示龙胆泻肝汤可导致HaCaT细胞内caspase-3激活，而抑制caspase-3的活性能有效逆转龙胆泻肝汤诱导的HaCaT细胞凋亡。因此，龙胆泻肝汤可通过激活caspase-3途径实现对HaCaT细胞的凋亡诱导作用。然而龙胆泻肝汤对Bax和Bcl-2表达调控的具体机制如何？龙胆泻肝汤是否直接调控Bax和Bcl-2来实现caspase-3的激活？龙胆泻肝汤是否还有其他的细胞凋亡调控靶点？此外，药物对细胞增殖抑制作用可能通过细胞毒性也可以通过凋亡和坏死等途径。我们发现低浓度龙胆泻肝汤就可以显著诱导细胞凋亡并激活凋亡关键标志物活性caspase-3的表达，提示凋亡途径在龙胆泻肝汤抑制HaCaT细胞增殖中具有重要意义。但同时，我们只进行了Tunel染色和活性caspase-3检测，不能排除其他途径也在该过程中发挥作用。针对这些问题还有待于在下一步工作中进一步研究。