重组蛋白类药物蛋白含量测定方法探究

李昊娜，许宏

（1.上海健康医学院，上海 201318；2.甘肃省武威市天祝藏族自治县第一中学，甘肃 武威 733200）

0 引言

重组蛋白是以重组DNA 或重组RNA 技术为基础而获得的一种蛋白质，重组蛋白类药物的研制与应用，为很多患者疾病治疗过程中带来了“曙光”，并且在政策、市场需求等因素的作用下，重组蛋白类药物的发展逐渐步入至“黄金时期”。加强重组蛋白类药物质量控制，是其是否能成功、顺利上市的决定因素[1]。蛋白含量检测是重组蛋白类药物质控的关键内容之一，但部分工作人员还不能娴熟操作相关方法，鉴于此本文对几种蛋白测量的常规方法作出探究。

1 重组蛋白类药物

重组蛋白类药物可以被视为由基因工程技术整改的“工程菌”或者是“工程细胞”大量表达出的机体功能性蛋白或相应的突变体，这样机体因为先天基因缺陷或后天性疾病等引起的对应功能蛋白缺失便实现了有效“补救”。既往国内外有很多学者指出[2]，建设完善化的质控体系有益于扫平重组蛋白类药物上市过程中的各类障碍，而蛋白含量检测是该类药物质控体系的关键指标之一，和活性测算、残余杂质控制及成品分装相比较，蛋白含量检测具有更大的现实意义。

2 蛋白定量检测的常规方法

2.1 标准定量法

①凯氏定氮法:使用该种方法检测药物蛋白含量，是基于分析含氮量进行的，反应进行过程中耗损掉的盐酸滴定液可以追溯到质量恒定时无水碳酸钠对应重量，可以将其设为含量标准品追溯始源的手段。大部分情况下，充足蛋白类药物的纯度处于较高水平，采用该种方法测量蛋白含量，不必顾虑他类含氮物质对测量结果精度形成的影响。但是若在制剂期间采用了含氮添加剂，则此时蛋白含量是总氮量与非蛋白氮量两者的差值。因为凯氏定氮法是利用含氮量将蛋白含量换算出来，在具体实践中应结合蛋白分子式准确计算出换算系数F。

②氨基酸分析法:该定量检测方法的功能在于能测量出构成蛋白质的各种氨基酸所占比重。在具体检测时，通常会应用以液相为基础的常规酸解法。先对蛋白样品实施酸水解处理，由此获得游离氨基酸溶液，继而在异硫氰酸苯酷（PITC）的协助下实现柱前衍生，此时氨基酸附带了疏水结构和吸收基团，最后在液相的支撑下实现精确分离与检测。这在计算环节中，建议先使用混标实现对各个氨基酸的定量，再利用多个公式测得蛋白含量指标。因为各氨基酸的水解程度存在差异，为保证蛋白含量检测结果的精确度，建议计算在水解内稳定、在蛋白内含量较高、分离度与回收率较高的氨基酸中进行。凯氏定氮法和氨基酸分析法均是当下国内外认可的检测蛋白含量“金标准”[3]，前种方法使用时最大的不足是需要投放较多的样品，一次测量大概耗损20 mg蛋白，而后者不适用于测量高度糖基化蛋白样品的蛋白含量。

2.2 比色分析法

已有大量研究证实[4]，Lowry 法、双缩脉法、BCA法及Bradford 法均是基于蛋白内特殊氨基酸或基团的呈色反应，采用对比显色深度的形式确定蛋白含量。应用该种方法测量蛋白含量时，选择适宜的标准样品是影响定量检测结果精确度的重要因素。以往通常会将牛血清白蛋白、人白蛋白设为替代标准品对蛋白含量定量检测，但不同蛋白的氨基酸分子构成、理化性质存在差异，很可能形成偏差，故而不能真切的呈现出待测样品的实际含量。

笔者认为，只有应用和待检样品材质等同的原料，并将其设为标准品，打造同质标准品，方可规避由以上情况产生的偏差。但是针对初期研发的种族蛋白药物，获取同质标准品存在较大难度，这在很大程度上限制了该种方法的推广。但是若能获取同质标准品，通过“标准定量法”对其进行标定处理以后，便可以采用该类方法常规检测蛋白含量。

另外，和其他方法相比较，比色分析法在使用过程中形成的蛋白一染料复合物的消光系数处于较高水平，这有益于提升检测结果的灵敏度，故而该种方法在蛋白质微量检测领域体现出良好效能。但多种干扰物质会干扰这种方法的应用过程，故而应以最严谨的态度加以选择应用。

2.3 紫外吸收法

因为Trp、Tyr 及Phe 结构内苯环含有共扼双键，故而蛋白质在280 nm 位置的紫外形成了吸收特胜。依照朗伯一比尔定律，在光程和消光系数已知条件下，采用检测蛋白样品280 nm 处OD 指标的形式，就可以检测到蛋白含量。故而，采用该种方法检测过程中，怎样科学确定晓光系数是需重点考虑的问题之一。历经周密性的文献调查研究，本文把当下确定蛋白消光系数的方法总结为如下四种类型，涵盖了一种经验公式法与三种试验检测法。

（1）经验公式法。EDELHOCH[5]提出并证实了在6mol/L 盐酸胍变性处置条件下，Trp、Tyr、S-S 模型化合物可用于等同条件下他类非折叠蛋白的消光系数。为能精确测算出临近自然折叠状态下蛋白质对应的消光系数，PACE 等[6]对公式内三种氨基酸的消光系数予以校正处理，并赋予新值，最后获得了（1）式:

其中，5500、1490、125 对应的依次是Trp、Tyr、S-S校正处理后的摩尔消光系数。

基于该种方法获得的消光系数一般被统一称之为理论消光系数，其和盐酸胍变性法获得的消光系数偏差约为4.0%。蛋白质氨基酸构成内色氨酸含量高低是影响偏差值高低的主要因素，偏差大小和色氨酸含量间呈反比例关系。若蛋白质氨基酸构成内无色氨酸，则偏差值通常＞10.0%，对其成因加以分析，主要和色氨酸消光系数偏高、对蛋白于280nm 位置吸光度贡献偏大存在相关性，并且诊断酸碱度、温度条件改变过程均没有表现出较高敏感性。

（2）盐酸胍变性法。尽管该方法也是基于Edelhoch构建了Trp、Tyr、S-S，但和经验公式法相比较，该法应用阶段分析了氨基酸周遭环境对其吸收值高低形成的影响，这提示利用该种方法检测到消光系数和自然折叠状态下蛋白质的消光系数相似度更高。

为方便理解，笔者在这里简要阐述如下操作方法:首先把同一蛋白溶液均等的氛围两种，一份加入6mol/L 盐酸胍溶液（将其标记成6MG），另一份加入等体积的配方缓冲液，有cnat=C6MG，也有ε280nat=ε280 6MG ×Anat/A6MG。其中，有ε280 6MG=a×εTyr+b×εTrp+c×TrpCystina=a×1285+b×5685+c×125。最终获得配方缓冲液内天然态对应的消光系数用公式（2）表示[6]:

其中，1285、5685、125 对应的是6mol/L 盐酸胍溶液内Trp、Tyr、S-S 于280 nm 位置的摩尔消光系数。

（3）碱水解法。Goodwin、Morton 共同建设以基于碱水解条件下的二元模型，等同于蛋白质在0.1 mol/L NaOH 溶液内发生碱性水解反应，可以将蛋白质溶液视作为Trp 与Tyr 的二元体系 。具体操作方法和盐酸胍变性法之间有很大相似处，最后获得配方缓冲液内天然态蛋白的消光系数用（3）式表示:

1576、5250 对应是分别是0.1mol/L NaOH 溶液内Trp、Tyr 于280nm 位置的摩尔消光系数。

（4）氨基酸分析法。可以利用蛋白质的序列信号捕获消光系数，也可以通过测算相关蛋白的氨基酸分析结果获得。尽管前种方法应用流程更具简洁性，但现实应用中也有很大局限性，这主要是由于在蛋白成品制剂内，掺和辅助用料以及添加剂，能驱动供试样品酸碱度（pH值）发生改变过程，对酪氨酸残基的离子态形成一定影响，进而作用于蛋白吸光度指标。这就预示着采用氨基酸分析法能获得精确度更高的消光系数。

该法先利用氨基酸分析法定量检测蛋白，而后基于朗伯-比尔定律测得精确度较高的消光系数，即为公式（4）[7]:

和其他几种方法相比较，紫外线吸收法具有操作过程简易、资金投入量少、不形成污染、定量检测后样品可以回收使用等诸多优势。采用经验公式法、盐酸胍变性法、氨基酸分析法及碱水解法能较准确的测定蛋白消光系数，弥补了蛋白定量不精确的缺陷。另外，利用基因重组技术制得的重组蛋白类药物，序列信息大体上是已知的，这在很大程度上降低了消光系数获得的难度，这也是紫外线法在重组蛋白类药物蛋白含量检测中广泛应用的主要原因之一。但是针对蛋白结构内无色氨酸、酪氨酸的重组蛋白类药物，紫外线吸收法不能体现出良好适用性。

在确定消光系数过程中，应予以如下问题一定重视:经验公式法应用过程中无需开展实验操作，仅需明确蛋白内Trp、Tyr、S-S 数目就能测算出消光系数，也可以把DNA 序列输送至生物信息学软件（ExPASy）直接捕获，但是缺点是该种方法在很大程度上没有考虑蛋白三维空间结构对消光系数做出的贡献。而三种实验检测法较好的弥补了该方面存在的不足，都分析到蛋白空间结构形成的影响，故而测算出的消光系数合自然折叠状态毗邻度更高，特别是利用氨基酸分析法能获得准确度更高的消光系数。故而，推荐在现实运用阶段，增设了对消光系数的试验证实与对比过程。

3 紫外吸收法检测ADC的蛋白含量

ADC 是由单抗、连接子及小分子药物共同构成组装体，单抗于280 nm 位置形成紫外吸收状况之外，小分子药物通常也会形成较明显的紫外吸收情况。故而，若直接采用单抗消光系数去测算ADC 的蛋白含量，结果精确度并不高。

本文在这里提及的内容是，朗伯一比尔定律对单组分体系的适用性欠佳，而在多组分体系内体现出较好的效能，若已知这些组分存有不同的吸收光谱并且组分间未形成相互作用，则在设定的波长（λ）下，该溶液对应的总吸光度是各组分单个吸光度之和可用（5）表示[8]:

结合以上原理，抗体在280 nm 处形成特征性吸收峰，基于此形成特定的消光系数E280 mAb，小分子药物在其吸收波长最大值位置存有特异性吸收峰，也会形成特定的消光系数Eλ（D） drug。同理，抗体与波长λ（D）有对应的消光系数E}λ（D） mAb，小分子药物于280 nm 波长处存有消光系数E280 drug。针对ADC 于280 nm 及λ（D）波长处形成的吸收值分别检测，能够求算出抗体浓度[6]。

除此之外，如果小分子药物与连接子于280 nm 位置均未产生吸收现象，则两者形成的影响可以忽略不计，这提示可以直接采用单抗的消光系数测算出ADC的蛋白含量。该种方法也经常被用来检测ADC 药物的DAR 值。

4 结论

本文阐述了当下检测重组蛋白类药物蛋白含量的常用方法，这些方法对样品的纯度提出较高要求，并且所罕有的敷料不能对检测过程形成扰乱，在经纯化处理的样品中体现出较好的适用性。而针对非目标蛋白含量较高的样品或者辅料内含有添加蛋白的成品，则一定要使用特异性较强的方法检测蛋白含量，比如免疫学检测法、HPLC 法等。利用紫外吸收法检测ADC 含量时，应全面分析单抗、连接子等对应的紫外吸收特性，进而从根本上保证蛋白质含量检测结果的精确度。