丁苯酞对阿尔茨海默病模型大鼠海马CA1区GSK-3β及p-Tau蛋白表达的影响

邓春颖 李海滨 毛文静 李世英

[摘要] 目的 观察丁苯酞（NBP）软胶囊对阿尔茨海默病（AD）模型大鼠海马CA1区丝氨酸蛋白激酶-3β（GSK-3β）、p-Tau蛋白表达的影响，探讨NBP治疗AD的机制。 方法 将72只雄性SD大鼠随机分为假手术组（24只）、AD模型組（24只）、NBP治疗组（24只）。采用β-淀粉样蛋白1-42（Aβ1-42）制作AD模型，假手术组注射5 μL生理盐水。造模成功后4周，NBP治疗组给予NBP与食用油混合后制成的NBP混合溶液灌胃;假手术组和AD模型组采用同等剂量的食用油进行灌胃。采用Morris水迷宫实验比较各组大鼠穿越平台次数。采用Western blot法分别于给药后1、2、4和8周检测海马CA1区GSK-3β、p-Tau蛋白的表达情况。 结果 与假手术组比较，AD模型组大鼠各时间点穿越平台次数显著减少（均P < 0.05）;与AD模型组比较，NBP治疗组各时间点大鼠穿越平台次数均增加（均P < 0.05）;与假手术组同期比较，AD模型组大鼠海马CA1区p-Tau、GSK-3β蛋白相对表达水平升高，差异有高度统计学意义（P < 0.01）;与AD模型组同期比较，NBP治疗组大鼠海马CA1区p-Tau、GSK-3β蛋白相对表达水平降低，差异有高度统计学意义（P < 0.01）;与假手术组同期比较，NBP治疗组大鼠海马CA1区p-Tau、GSK-3β蛋白相对表达水平升高，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。 结论 NBP可通过下调GSK-3β、p-Tau蛋白的表达，发挥对AD模型大鼠的脑保护作用。

[关键词] 丁酚酞;阿尔茨海默病;丝氨酸蛋白激酶-3β蛋白;p-Tau蛋白

[中图分类号] R741.02          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）09（c）-0016-04

Effects of Butylphthalide on the expression of GSK-3β and p-Tau proteins in CA1 region of hippocampal of Alzheimer′s disease rats

DENG Chunying1   LI haibin2   MAO Wenjing1   LI Shiying1

1.Department of Neurology， North China University of Science and Technology Affiliated Hospital， Hebei Province， Tangshan   063000， China; 2.Department of Cardiology， People′s Hospital of Zunhua， Hebei Province， Zunhua   064200， China

[Abstract] Objetive To observe the effects of Butylphthalide （NBP） on the expression of glycogen synthase kinase-3β （GSK-3β） protein and p-Tau protein in CA1 region of hippocampus of Alzheimer′s disease rats， and to explore the mechanism of brain protection by butylphthalide. Method Seventy-two male SD rats were randomly divided into sham operation group （24 rats）， AD model group （24 rats） and NBP treatment group （24 rats）. Aβ-amyloid 1-42 （Aβ1-42） was used to make AD model. The sham operation group was injected with 5 μL saline. Four weeks after successful modeling， NBP treatment group was given NBP mixed solution made of NBP and edible oil by gavage. The sham operation group and the AD model group were given the same dose of edible oil. Morris water maze experiment was used to compare the number of times the rats crossed the platform. Western blot was used to detect the expression of GSK-3β and p-Tau proteins in the hippocampal CA1 region at one， two， four and eight weeks after administration. Results Compared with the sham operation group， the number of rat crossing the platform at each time point in AD model group was significantly reduced （all P < 0.05）. Compared with AD model group， the number of rats crossing the platform increased at each time point in the NBP treatment group （all P < 0.05）. Compared with the sham operation group in the same period， the relative expression levels of p-Tau and GSK-3β proteins in the hippocampal CA1 area of the AD model group were increased， and the differences were highly statistically significant （P < 0.01）. Compared with the AD model group in the same period， the relative expression levels of p-Tau and GSK-3β proteins in the hippocampal CA1 area of rats in the NBP treatment group were decreased， and the differences were highly statistically significant （P < 0.01）. Compared with the sham operation group in the same period， the relative expression levels of p-Tau and GSK-3β proteins in the hippocampal CA1 area of rats in the NBP treatment group were increased， and the difference was statistically significant （P < 0.01）. Conclusion NBP can play a protective role on the brain of AD model rats by down-regulating the expression of GSK-3β and p-Tau protein.

[Key words] Dl-3-n-Butylphthalide; Alzheimer′s disease; Glycogen synthase kinase-3β protein; p-Tau protein

阿爾茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）是一种神经系统退行性疾病，是痴呆的主要原因[1]，以进行认知功能障碍为特征，表现为记忆力减退、言语障碍、定向力障碍等[2]，逐渐丧失生活能力，给家庭带来沉重负担。全球痴呆症总人数约为2400万，且以惊人的速度增长[3]，但目前病因尚不明确[4]，尚无特效药物预防和延缓AD的发展。AD患者脑中过度磷酸化的Tau蛋白与微管结合能力降低，其在细胞内聚集形成神经纤维缠结，从而干扰神经元功能，并导致神经元变性坏死[5-6]。糖原合成激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）与p-Tau的形成密切相关，且参与调节Tau蛋白异常磷酸化，此激酶异常激活可导致Tau蛋白过度磷酸化而产生的临床症状[7-8]。丁苯酞（Butylphthalide，NBP）作为我国自主研发的新药，主要用于治疗缺血性脑血管病[9]，另外还能抑制神经细胞凋亡、抑制炎症反应等[10]。近年有研究显示NBP可改善AD患者的认知功能，但其具体机制尚不明确，本研究通过研究NBP对GSK-3β、p-Tau蛋白表达的影响，探讨NPB治疗AD的可能作用机制。

1 材料及方法

1.1 实验动物

选取实验大鼠72只，2～3月龄，健康清洁级雄性Sprague-Dawley（SD），体重250～280 g，实验动物由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，许可证号为：SCXK[京]2014-0010。实验动物喂养于动物实验室，室温维持在24～26℃，湿度维持在45%～55%，12 h明暗交替光照，实验前适应喂养1周。实验过程中对动物操作符合科技部颁布的《关于善待实验动物的指导意见》[11]的相关要求。

1.2 药物、试剂及仪器

NBP软胶囊（石药集团恩必普药业有限公司批号：121101，规格0.1 g/粒）;兔抗大鼠GSK-3β多克隆抗体（北京博奥森生物公司，批号：12456s）;兔抗大鼠p-Tau多克隆抗体（Abcam 公司，批号ab109390）;兔二步法免疫组化试剂盒、二氨基联苯胺显色液、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳低分子质量标准蛋白（北京中杉生物有限公司，批号：PV-9001、K116610D、D0032-1）。石蜡组织切片机（德国LEICA公司，RM2 235）;脑立体定位仪（安徽淮北正华生物仪器设备有限公司，ZH-蓝星B/S）;Morris水迷宫（安徽淮北正华生物仪器设备有限公司）;透射电子镜（日本HITACHI公司，H-9500）;电凝仪（张家港市航天医疗电器有限公司，JGD-50B）。

1.3 方法

1.3.1 动物分组  72只SD大鼠采用随机数字表法分为假手术组、AD模型组、NBP治疗组，每组各24只。造模成功后，将AD模型组、NBP治疗组实验大鼠再随机分为造模后1、2、4周和8周4个亚组（每个亚组6只），假手术组随机分成同上4个亚组。

1.3.2 模型制备  提前制备Aβ1-42溶液（浓度为1 μg/μL），制成凝聚状态。通过Morris水迷宫筛选合格实验动物。腹腔注射麻醉大鼠（10%水合氯醛，350 mg/kg），麻醉后将大鼠固定于脑立体定位仪上，选择双侧海马CA1区（以前囟为基准点，向后4.5 mm，中线旁开2 mm处），微量注射器与脑表面垂直，缓慢进针2 mm，AD模型组及NBP治疗组均缓慢注射5 μL已配备好的聚集态的Aβ1-42溶液，留针10 min后撤出针头，封闭骨质创口，缝合切口，手术区消毒。假手术组注射5 μL生理盐水。

1.3.3 给药方法  造模成功后4周进行下一步实验。NBP治疗组给予NBP混合溶液（NBP与食用油混合，浓度为8 mg/mL，灌胃剂量为100 g/mL），2次/d;假手术组和AD模型组亦给予灌胃处理，给予等剂量的食用油灌胃，2次/d，分别连续给药1、2、4、8周。

1.3.4行为学测试  造模成功给药后，采用Morris水迷宫实验检测实验大鼠的学习记忆能力[12]。分别观察各组实验大鼠灌胃给药后1、2、4周和8周穿越平台的次数。

1.3.5 Western blot检测  大鼠喂养至各个时间点后，腹腔注射麻醉大鼠（10%水合氯醛，350 mg/kg），冰台断头取脑，分离出海马组织。将取出的脑组织充分研磨后，置入15 mL离心管中，加组织裂解液，浆器中充分裂解40 min，4℃，60 mm，12 000 r/min，离心10 min，取上清液，-80℃冰箱保存备用。将蛋白定量分装后调整蛋白浓度（800 μg/mL），加等量上样缓冲液，沸水中煮5 min后备用。检测方法：取等量蛋白样品（50 μg）置于10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酸铵凝胶电泳，以湿转法电转移至聚偏二氟乙烯膜膜上，室温封闭至少2 h。分别加入相应一抗，GSK-3β抗体（1∶500）、p-Tau抗体（1∶500），4℃冰箱孵育过夜，次日磷酸盐缓冲液漂洗后加入羊抗兔二抗（1∶2000），37℃反应2 h，磷酸盐缓冲液洗膜3次，加5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸/氯化硝基四氮唑蓝显色，显色数分钟，双蒸馏水终止显色，Image J软件进行灰度值测定分析。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行分析。计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，各组间数据比较采用双因素重复测量方差分析，以分组和时间作为双因素方差分析的独立因素，进行Bonferroni校正。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 結果

2.1 各组大鼠学习记忆能力的检测结果

与假手术组比较，AD模型组及NBP治疗组大鼠各时间点穿越平台次数显著减少，差异有统计学意义（均P < 0.05）;与AD模型组比较，NBP治疗组各时间点大鼠穿越平台次数均增加，差异有统计学意义（均P < 0.05）。见表1。

2.2 各组大鼠海马CA1区p-Tau、GSK-3β蛋白相对表达水平

与假手术组比较，AD模型组大鼠各时间点海马CA1区p-Tau、GSK-3β蛋白相对表达水平升高，差异有高度统计学意义（P < 0.01）;与AD模型组比较，NBP治疗组大鼠各时间点海马CA1区p-Tau、GSK-3β蛋白相对表达水平降低，差异有高度统计学意义（P < 0.01）;与假手术组比较，NBP治疗组大鼠各时间点海马CA1区p-Tau、GSK-3β蛋白相对表达水平升高，差异有高度统计学意义（P < 0. 01）。见表2～3、图1。

A：各组不同时间点大鼠海马CA1区p-Tau蛋白表达灰度值;B：各组不同时间点大鼠海马CA1区GSK-3β蛋白表达灰度值。GSK-3β：丝氨酸蛋白激酶-3β

3 讨论

AD病因复杂，是一种原发性神经系统退行性疾病，以认知功能缓慢进行性下降为特征[13-14]，目前无特效方法治疗此病。NBP是我国自主研发的用于治疗缺血性脑血管病的新药，研究显示它除了可以改善循环、抗自由基外，还有抗氧化、抗炎、抗凋亡[15-16]，可以一定程度地改善患者认知功能[17-18]。本研究结果显示AD模型组大鼠学习记忆能力下降，采用NBP灌胃治疗后大鼠的学习记忆能力得到改善，与AD模型组比较，NBP治疗组大鼠穿越平台次数增加。

海马属于大脑边缘系统，参与学习、记忆等过程，研究认为海马结构及功能发生改变与认知功能密切相关[19]。结合文献本研究采用Aβ1-42溶液向双侧海马区注射制作AD模型，此模型受损部位明确，可迅速建立痴呆模型，较全面地模拟AD的全过程，包括病理改变及行为改变。在AD早期，海马区首先受累，较公认的假说是该部位Aβ 淀粉样学说和Tau蛋白学说[20]。Tau蛋白学说研究中，Tau及p-Tau蛋白是研究热点之一。GSK3又称 Tau磷酸化激酶，有糖原合成激酶-3α（GSK-3α）和GSK-3β两种形式，主要存在于大脑皮质、海马、浦肯野细胞等。GSK-3β是一种Tau磷酸化激酶，接受多种胞内信号调控，参与多种生物机能，其中包括学习记忆[21-23]。它与p-Tau蛋白的形成有关。调控GSK-3β的活性主要是AKT蛋白参与，它可抑制GSK-3β活性，当其合成障碍时，GSK-3β被激活引起Tau蛋白异常磷酸化[24]，异常磷酸化的Tau蛋白聚集形成螺旋丝，最终导致纤维缠结。有研究显示，氧化应激反应能增加GSK-3β活性，而抑制其活性，既能缓解缓氧化应激反应，又能减少细胞凋亡[25]。本实验采用Western blot法检测实验大鼠海马GSK-3β、p-Tau蛋白的表达，结果显示在假手术组各时间点海马CA1区GSK-3β、p-Tau蛋白均有少量表达。在AD模型组大鼠各时间点表达均增多，4周时表达量最高，8周时稍有下降，但仍处于较高水平。而与AD模型组比较，在NBP治疗组大鼠中，GSK-3β、p-Tau蛋白表达均有下降。GSK-3β、p-Tau蛋白表达的结果与行为学检测结果一致，NBP可通过下调GSK-3β、p-Tau蛋白的表达发挥闹保护作用。

综上所述，NBP可以改善AD模型大鼠学习和记忆能力，其机制可能是下调GSK-3β、p-Tau蛋白的表达，从而抑制Tau磷酸化，达到脑保护作用。

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（收稿日期：2020-04-10）