动植物DNA主动去甲基化途径及其调控机制研究进展

刘春雨,王 宇,解莉楠

(东北林业大学生命科学学院东北盐碱植被恢复与重建教育部重点实验室,中国黑龙江哈尔滨150040)

DNA甲基化是以S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)作为甲基供体,经DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase,DNMT)催化,在胞嘧啶的5位碳原子上添加1个甲基的过程,是一种很重要的表观遗传修饰。DNA甲基化调节基因的表达和沉默,与癌症和老年痴呆等许多疾病密切相关,同时也调控很多关键的生物学过程,如抑制印记基因表达、使X染色体失活、控制基因组织特异性表达等[1]。

DNA甲基化分为从头合成甲基化和维持甲基化。目前,人们已在哺乳动物中鉴定出3种DNA甲基转移酶:DNMT1、DNMT3A和DNMT3B。DNMT1负责维持DNA甲基化,而DNMT3A和DNMT3B则负责DNA甲基化的从头合成[2]。DNMT3L(DNMT3-like)虽然没有甲基转移酶的催化活性,但是可以调控DNMT3A和DNMT3B的表达[3～4]。动物中的DNA甲基化主要发生在CG位点,并且在整个基因组范围内的CG位点都是高甲基化。植物中的DNA甲基化存在3种不同的类型,包括对称的CG、CHG和非对称的CHH(H代表碱基A、T或C)位点的甲基化,这些不同位点的甲基化的从头合成都是由RNA介导的DNA甲基化 (RNA-di rected DNA methylation,RdDM)途径来实现的[5]。通常,不同位点的甲基化需要不同的酶来维持。甲基转移酶1(methyltransferase 1,MET1)是哺乳动物DNMT1的同源体,负责维持CG类型的甲基化[6]。CMT3(chromomethylase 3)是植物中特有的DNA甲基转移酶,是维持CHG位点甲基化所必需的[7]。DRM2(domains rearranged methyltransferase 2)在维持CHH位点甲基化的作用中最为突出,因为CHH位点的甲基化主要依赖于DMR2参与的RdDM途径,并且DMR2的活性受到Rd-DM途径的调控[8～9]。动植物中的DNA甲基化不仅在发生位点上有所不同,而且在发生部位上也不尽相同。植物中的DNA甲基化主要发生在转座子和其他重复的DNA序列；动物中的DNA甲基化则发生在基因的启动子区,主要抑制下游基因的表达。

为了保证基因在适当的发育阶段进行程序性表达,生物体内也会发生DNA去甲基化(demethylation)的现象。DNA去甲基化是指5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5mC)被胞嘧啶取代的过程[10～11]。DNA去甲基化的过程要比甲基化的过程复杂得多。一般认为,DNA去甲基化有两种方式:主动去甲基化(active demethylation)和被动去甲基化(passive demethylation)[10～11]。被动去甲基化发生在 DNA复制时期。DNA复制属于半保留复制,新合成的DNA链是没有任何修饰的。在正常情况下,一系列DNA甲基转移酶参与DNA从头修饰。当这类维持机制被抑制或失活时,每次复制都只会产生没有发生甲基化修饰的DNA。这样在多代复制后,生物体中的总体DNA甲基化水平就会逐渐降低。但通过这种“稀释”的模式去除DNA甲基化的效率极低。所以,生物体需要通过其他的方式调节DNA甲基化程度,以应答体外环境的变化。因此,主动去甲基化的过程在生物体内至关重要。与DNA甲基化形成和维持机制相比,DNA去甲基化的机制还有待进一步得到阐释,本文主要对动植物中DNA主动去甲基化途径及其调控机制的最新研究进展进行综述及比较分析,为后续相关研究提供理论支持。

1 植物DNA主动去甲基化

1.1 植物DNA主动去甲基化酶的发现及结构分析

多项研究表明,植物体内的DNA主动去甲基化过程主要是通过ROS1/DME(repressor of silencing 1/demeter)介导的碱基切除修复(base excision repair,BER)机制来实现的[12～13]。2002 年Gong 等[14]利用RD29A-LUC(RD29A-luciferase)系统筛选到ros1突变体,该突变体导致RD29A启动子处的DNA甲基化过高,从而使其沉默；同时,体外实验证实ROS1具有DNA糖基化酶的活性,这为后续的研究奠定了基础。同年,Choi等[15]在拟南芥中研究胚胎和胚乳发育过程时筛选到了dme突变体,随后Gehring等[16]通过进一步研究发现,在dme突变体的种子胚乳中CG甲基化水平有所升高,表明DME可能在DNA去甲基化的过程中起作用。另有研究报道,该家族蛋白中的另外两个蛋白质DML2(demeter-like 2)和 DML3(demeter-like 3)也能够识别所有类型的胞嘧啶甲基化并切除5mC[17]。相关的序列对比分析结果显示,拟南芥ROS1/DME家族蛋白结构中都包含HhH-GPD(helix-hairpinhelix-Gly-Pro-Asp)结构域、FES(4Fe-4S)簇结构域、与组蛋白H1相似的H1结构域和未知功能的DUF结构域(图1)。其中,FES结构域负责酶的激活,HhH-GPD结构域在ROS1/DME双功能酶活性发挥中起着关键的作用[18]。

1.2 ROS1/DME介导的DNA主动去甲基化途径

ROS1/DME介导的DNA主动去甲基化途径是一种类似于DNA损伤修复中的碱基切除过程。当甲基化的DNA存在时,ROS1/DME会识别甲基化的胞嘧啶并且水解DNA链中的脱氧核苷酸和碱基之间的糖苷键,从而将其切除。当裂解DNA骨架时,ROS1和DME催化β消除反应或δ消除反应(图 2)。β 消除反应会产生 3′-磷酸-α,β-不饱和醛(3′-phosphoric acid-α,β-unsaturated aldehyde,3′-PUA)间隙,而 δ消除反应则会产生 3′-磷酸末端间隙[13,19]。3′-磷酸和 3′-PUA 都会转化为 3′-羟基(3′-OH),以便在DNA聚合酶和连接酶活性下可以填补间隙。许多蛋白质参与了DNA去甲基化的过程,如ZDP(zinc finger DNA 3′phosphoesterase)和 APE1L(apurinic/apyrimidinic endonuclease)。全基因组甲基化分析表明,zdp突变体中上百个内源基因位点高度甲基化,这可能是由于在突变体中去甲基化的过程受到了阻碍；随后相关研究发现ZDP与ROS1具有相互作用[20～21]。APE1L与ROS1蛋白在体内共定位,ape1l突变体种子胚乳中甲基化水平增加,从而降低受去甲基化酶DME调控的印记基因FWA(flowering wageningen)和MEA(medea)的表达水平。此外,生化数据表明纯化的ZDP蛋白可以将3′-磷酸基团转化为3′-OH基团[20,22],而APE1L蛋白可以将3′-PUA末端加工为3′-OH末端[23],所以ZDP和APE1L产生3′-OH的过程作为两个独立的分支共同参与ROS1/DME介导的DNA去甲基化。甲基化的胞嘧啶被切除以后,未甲基化的胞嘧啶如何填补缝隙？这一问题至今还没有确切的答案,目前在拟南芥中鉴定到了具有DNA连接酶活性的AtLIG1(Arabidopsis thaliana DNA ligase 1),它可以在DNA链的两端连接上未甲基化的胞嘧啶,从而实现去除DNA甲基化的目的[24～25](图 2)。

图1 拟南芥ROS1/DME家族蛋白结构域[18]Fig.1 The domains of Arabidopsis ROS1/DME family proteins[18]

图2 碱基切除修复介导的植物DNA主动去甲基化[21,23]Fig.2 Base excision repair-mediated DNA active demethylation in plants[21,23]

1.3 ROS1介导的DNA主动去甲基化的调控

ROS1介导的DNA主动去甲基化过程受许多因素的调控,比如:转录水平上受到的调控、酶活性水平上受到的Fe-S基序调节。此外,ROS1识别靶位点的过程还受到各种蛋白质复合物的影响。

1.3.1 ROS1转录水平的调节

ROS1基因的表达受许多因素调节。其可与RdDM途径相互拮抗来预防特异位点上的DNA超甲基化,并且在所有已知的RdDM相关的突变体中ROS1的表达量均降低,说明DNA甲基化和主动去甲基化之间是相互协调的关系[26～30]。除Rd-DM相关的突变体外,met1突变体中ROS1的表达同样被抑制[31]。ROS1启动子上有一段可以调控甲基化水平的39 bp序列,被称为DNA甲基化监测序列(methylation monitoring sequence,MEMS)[29]。RdDM途径使全基因组的甲基化升高,MEMS上的高甲基化促进了ROS1的表达,防止甲基化过高,从而使机体甲基化保持平衡。MEMS的高甲基化发生在ROS1功能缺失的突变体中,说明MEMS也是ROS1的靶位点。相关研究报道,MEMS的超甲基化伴随着ROS1的表达增加,并导致拟南芥的根系长度显著增加[29,32]。在MEMS的上游包含一个螺旋状的转座子,该转座子可能有助于吸引DNA甲基化因子,并使启动子对DNA甲基化作出反应,但是通过DNA甲基化促进ROS1转录的特异性转录因子尚未发现[33]。综上可知,MEMS可通过调控ROS1的表达来协调DNA甲基化与去甲基化之间的平衡,避免DNA甲基化的过低或过高,进而维持生物体良好的生长发育状态。

1.3.2 ROS1酶活性水平的调节

ROS1功能的发挥不仅受转录水平的调控,还受酶活性水平的调节。很多研究都关注了ROS1/DME去甲基化酶的表观遗传学功能,但是人们对其酶活性调控机理仍知之甚少。早在30年前,相关研究就发现一种在碱基切除修复(BER)过程中起作用的DNA糖基化酶(DNA glycosylase)中含有Fe-S簇结构域,并且该结构域对其酶活性的保持至关重要[34]。现有研究显示,ROS1/DME去甲基化酶中也含有同样保守的Fe-S功能域(如图1中的FES),且该结构域是ROS1/DME活性所必需的,Fe-S基序突变的DME蛋白在体外不能切开甲基化的DNA[35～36]；同样的体外实验在ROS1中也得到了相同的结果[32]。以上信息表明,Fe-S基序对ROS1/DME蛋白酶活性的保持具有重要的作用。

1.3.3 ROS1靶位点识别水平的调节

除上述两种调控外,ROS1识别DNA甲基化位点的过程也受到多种因子的调控。目前DNA主动去甲基化途径的下游反应已经取得了突破性的进展,但是去甲基化酶识别甲基化胞嘧啶的具体过程仍然有待探索。当前研究已经筛选到了一系列参与DNA主动去甲基化位点识别的酶和相关因子,这些酶和因子相互作用,共同参与了ROS1识别甲基化DNA的过程[37～42]。该过程可以简要概括为以下四步:第一步,蛋白乙酰化酶(increased DNA methylation,IDM)复合体识别甲基化的胞嘧啶,并且在该位点对组蛋白进行乙酰化修饰；第二步,染色质重塑复合体SWR1识别组蛋白乙酰化标记,并被招募到染色质上；第三步,SWR1复合体在染色质上招募H2A.Z蛋白[43]。H2A.Z是组蛋白H2A的变体,主要位于常染色质区域,其在DNA高甲基化区域的水平较低,存储H2A.Z的复合体发生突变会导致全基因组DNA甲基化水平的升高[44]；第四步,H2A.Z和ROS1直接相互作用,将ROS1招募到甲基化胞嘧啶上进行DNA主动去甲基化过程(图3)。

2 动物DNA主动去甲基化

2.1 动物DNA主动去甲基化关键酶的发现及结构分析

过去的几十年中,人们一直在动物中寻找像植物中ROS1/DME一样可以直接去除DNA甲基化的酶,但始终没有鉴定出ROS1/DME同源蛋白,这表明动物中直接切除甲基化胞嘧啶的化学反应可能并不存在。Kriaucionis等[45]发现哺乳动物细胞中的甲基化胞嘧啶可转化为5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine,5hmC)。Song 等[46]研究发现5hmC在脑组织和多能胚胎干细胞中尤其丰富,并且这些5hmC存在于高CpG含量的启动子上,这些启动子的DNA甲基化水平通常较低。Williams等[47]经过一系列研究发现,在动物中一些关键分子间接作用于DNA去甲基化过程。这些酶首先修饰甲基化的胞嘧啶,随后使其被DNA碱基修复途径去除。2002年,Ono等[48]发现TET(ten-eleven translocation)蛋白可以使5mC转化为5hmC；2009年,Rao等[49]发现TET1过表达细胞的基因组DNA在CG中含有修饰,推断它可能在高等生物中介导5mC羟基化。进一步的研究显示TET1确实能够使哺乳动物DNA中的5mC转化为5hmC,这为TET1在DNA去甲基化中的作用提供了证据[49]。

图3 IDM、SWR1和H2A.Z在DNA主动去甲基中的工作模型[43]Fig.3 Working model for the roles of SWR1,IDM and H2A.Z in active DNA demethylation[43]

TET 蛋白是 Fe(Ⅱ)/α-酮戊二酸(α-ketoglutaric acid,α-KG)依赖型双加氧酶。TET蛋白家族包含3个成员,分别是TET1、TET2和TET3,其中TET1在小鼠体细胞中以TET1s的形式存在,在胚胎干细胞和原始生殖细胞中以TET1e的形式存在[50]。TET3也有两个亚型,分别为TET3s和TET3o,前者在神经元分化期间表达量较高,后者则在卵母细胞中大量表达[51～52]。TET家族所有成员(包含亚型)都含有双链β螺旋(double stranded β helix,DSBH)和富含半胱氨酸(Cys-rich)结构域[53](图4)。这些结构域在TET蛋白参与DNA主动去甲基化的过程中具有关键作用,其中DSBH结构域负责TET对5mC的氧化,Cys-rich结构域负责TET与DNA之间的结合。另外,TET1和TET3所特有的CXXC结构域负责TET蛋白在CpG岛区域内的富集。CXXC结构域缺失的突变体中TET蛋白在CpG岛的富集率有所降低,表明该结构域在TET蛋白靶向到特定的DNA位点过程中发挥了重要的作用[55]。

图4 小鼠TET蛋白的结构域[54]Fig.4 The domain of the mouse TET protein[54]

2.2 TET介导的DNA主动去甲基化途径

尽管动物不能像植物那样直接将甲基化胞嘧啶切除,但是动物体内也有独特的去除甲基化胞嘧啶的方式。目前,人们已提出几种可在动物中介导DNA主动去甲基化的机制[56～58],其中TETTDG(thymine DNA glycosylase)途径得到了最广泛的支持[54]。在该途径中5mC可以被TET蛋白逐步氧化成5hmC、5-甲酰基胞嘧啶(5-formylcytosine,5fC)和 5-羧基胞嘧啶(5-carboxycytosine,5caC)[59～60],然后通过胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)和碱基切除修复(BER)机制除去5fC和5caC,完成5mC的主动去甲基化(图5)。

图5 哺乳动物中TET介导的DNA主动去甲基化[58]Fig.5 TET-mediated DNA active demethylation in mammals[58]

在TET蛋白介导DNA主动去甲基化的过程中,5mC、5hmC和5fC都是其底物,但TET蛋白对这3种底物表现出不同的结合或催化活性。生化和结构研究表明,相对于5hmC和5fC,TET蛋白优先选择5mC作为其反应的底物；酶动力学分析显示,人TET1或TET2催化5mC至5hmC的转化速率快于5hmC至5fC和5fC至5caC的转化速率[61]。并且,无论互补链的状态如何,CpG体系中TET蛋白参与5mC的氧化速率大致相似[45]。TET蛋白的这种底物偏好性在生物体内是十分重要的,因为DNA主动去甲基化的过程伴随着许多DNA从头合成甲基化和DNA复制的反应。

2.3 TET介导的DNA主动去甲基化的调控

TET介导的DNA主动去甲基化反应可以在各种水平被调节,5mC、5hmC和5fC被氧化的反应直接受到底物活性的影响,同时这些反应也可以通过辅助因子调节。与植物中ROS1一样,TET可以在转录和翻译水平进行调节。此外,将TET靶向到甲基化DNA区域的因子也可以调节其识别靶位点的过程,但是与植物中ROS1识别靶位点的过程有所不同。

2.3.1 TET蛋白氧化过程的调控

TET蛋白介导的氧化反应需要α-KG和氧气作为底物,并以Fe(Ⅱ)为辅助因子。在该反应中,Fe(Ⅱ)首先与TET蛋白中保守的His-Asp残基结合,并且与H2O和α-KG相互协调,然后α-KG被氧气氧化生成CO2和琥珀酸酯,并产生高价的Fe(Ⅳ)中间体,该中间体与5mC反应生成5hmC和琥珀酸盐[62]。当反应所需的底物和辅助因子发生变化时会导致氧化反应产生不同的结果。α-KG由异柠檬酸通过异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase,IDH)氧化脱羧反应产生[63],IDH1或IDH2的过表达能够促进细胞中5hmC的产生[64～65]。此外,idh突变体可通过产生2-羟基戊二酸(2 hydroxyglutarate,2HG)与α-KG竞争性结合来抑制TET蛋白活性,进而使5mC无法转化为5hmC[64]。除α-KG外,氧气对TET蛋白介导的氧化反应的影响已在体外量化[66],缺氧会降低5hmC的水平但不会使TET蛋白表达下调,并且该变化与细胞增殖和代谢物浓度的变化无关,这表明氧气可直接参与调节TET蛋白介导的氧化反应[66]。作为反应的辅助因子,Fe(Ⅱ)也能够影响TET蛋白的活性,细胞中铁浓度的增加可提高5hmC的水平[67]；TET结构中与铁结合的关键残基的突变会降低其酶活性[66]。

2.3.2 TET转录水平的调控

除上述底物和辅助因子会影响氧化反应外,TET的功能在转录水平上也会受到调控。与植物中MEMS参与ROS1转录水平调节不同的是,TET和TDG的mRNA水平受到很多微RNA(microRNA,miRNA)调节[68]。其中,miR-15b、miR-22和miR-125等过表达会降低TET的表达并且降低 5hmC 的水平[68～70]；miR-26a 和 miR-29 过表达会抑制TDG的表达,而敲除这两个miRNA则可增强TDG的表达,5hmC的水平与TDG的变化趋势一致[71～72]。

2.3.3 TET翻译后水平的调控

TET蛋白不仅在转录水平受到调控,而且在翻译后修饰上也受到调控。翻译后,TET蛋白酶活性可通过共价修饰和蛋白质之间的相互作用来调节[73]。研究显示,TET蛋白保守的赖氨酸残基泛素化能够促进TET蛋白与染色质的结合,在人TET2蛋白的N端,两个保守的赖氨酸残基发生乙酰化能够提高其酶活性,增强其在氧化应激下对5mC的靶向性[74]。TET蛋白的水平也可以通过蛋白质-蛋白质相互作用和蛋白质水解来调节,TET2蛋白的分子伴侣IDAX(inhibition of the Dvl and Axin complex)过表达会导致TET2蛋白的降解,而将IDAX耗尽则会使TET2蛋白含量升高[75]。钙蛋白酶在小鼠胚胎干细胞的维持和分化过程中介导TET蛋白水解[76],泛素蛋白酶则在人癌细胞介导TET2的降解,进而导致5hmC水平的降低[74]。

2.3.4 TET靶位点识别水平的调控

与ROS1类似,TET蛋白对基因组中甲基化DNA的识别也会受到调控。但是与植物中一系列酶和复合物参与ROS1识别靶位点的过程不同,动物中这一过程需要TET和TDG的结构特性、局部染色质环境以及外在因素相协调。为了有选择性地在特定CpG位点去甲基化,TET和TDG需要被定位到相应的基因组区域。在小鼠胚胎干细胞中进行的染色质免疫沉淀测序(chromatin immunoprecipitation sequencing,ChIP-seq)分析显示,TET1在CpG岛和二价启动子处富集,这种CpG结合偏好性是由于TET蛋白的CXXC结构域会优先选择富含CpG区域[56],这表明CXXC结构域促进了TET1与CpG岛的结合。对于没有CXXC结构域的TET2蛋白,这种结合可能是由其相互作用蛋白质IDAX来介导[77]。TET2蛋白的分子伴侣也有助于将其招募到甲基化DNA位点上。研究报道,PRDM14(PR domain zinc finger protein 14)、PRC2(polycomb repressive complex 2)和LIN28A在小鼠胚胎干细胞中可以招募TET蛋白并与其相互作用[77～79]。在小鼠胚胎干细胞中,TDG与TET1具有类似的分布模式,并且在活性启动子和增强子处富集,这种分布模式可能是由于TET与TDG之间存在相互作用[80]。此外,还有其他因素参与TET靶位点识别的过程,如生长停滞、DNA损伤诱导蛋白(GADD45A)和雌激素受体β等[81～82]。

3 总结

植物和动物通过相似的机制来调控DNA从头合成甲基化和甲基化的维持,但其主动去甲基化的过程具有一定差异。动植物中的DNA主动去甲基化大致都需要经历三步反应。在植物中,ROS1/DME首先将5mC切除,酶切产物经β消除反应或δ消除反应分别生成3′-PUA间隙和3′-磷酸间隙,随后3′-PUA间隙和3′-磷酸间隙分别在APE1L和ZDP的催化下生成3′-OH基团,最后通过碱基切除修复机制完成5mC的去除(图2)。在动物中,TET-TDG介导的DNA去甲基化途径被广泛认可,其主要过程如下:TET蛋白先将5mC氧化成5fC和5caC,随后由TDG将它们切除,最后通过碱基切除修复机制获得未修饰的胞嘧啶(图5)。尽管动植物中DNA主动去甲基化过程的最后都是通过相同机制完成的,但是在反应初期植物是通过ROS1/DME直接将5mC切除,而动物则需要在TET的催化下逐步将5mC氧化为5hmC、5fC和5caC后再实行胞嘧啶的切除。虽然动物中目前仍然没有找到类似于ROS1/DME可以直接切除甲基化胞嘧啶的糖基化酶,但是已经确定动物中的DNA去甲基化是由5mC的修饰开始,包括脱氨基作用、氧化作用、甲基团脱氢,而不是直接移除甲基基团。综上所述,动物DNA主动去甲基化途径比植物要更复杂。

有趣的是,研究者利用CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)基因编辑技术将不具有切割活性的dCas9(dead Cas9)与TET1催化结构域融合后转化模式植物拟南芥,成功地实现了目标基因的靶向去甲基化,最终激活了FWA基因的表达,产生了延迟开花的表型,为TET蛋白能够介导DNA去甲基化提供了佐证[83]。植物中没有TET酶,这表明TET1介导的去甲基化机制较为保守,但在进化的过程中DNA主动去甲基化的途径产生了分歧,植物通过ROS1切除而动物则通过TET的氧化作用最终去除5mC。

在调控方面,植物ROS1介导的去甲基化与RdDM途径的甲基化之间有一个动态反馈抑制环,即RdDM途径使MEMS上的高甲基化促进了ROS1的表达,而ROS1表达后又抑制全基因组的高甲基化,从而使植物基因组甲基化处于一个合理的水平。在动物中目前还没有发现这种机制,TET的表达更多受miRNA调控。

此外,本文还总结了参与植物和动物DNA主动去甲基化过程的关键酶及调控该过程的关键因子,具体如表1和表2所示。

表1 参与动植物主动去甲基化的关键酶及其功能Table 1 Key enzymes involved in active demethylation of plants and animals and their functions

表2 动植物主动去甲基化过程的调节因子及其功能Table 2 Regulators and functions of active demethylation in animals and plants

4 展望

尽管现在DNA去甲基化途径的研究已经取得了重大的突破,但是仍有许多环节尚不明确。对于植物DNA去甲基化而言,DNA去甲基化酶是如何精准地作用到靶位点上的？目前,除了在拟南芥中发现的IDM和SWR1复合体参与的调控机制外,是否还有其他的调控通路？另外,在其他作物中DNA去甲基化酶的精准调控机理尚未被发掘。本课题组利用CRISPR/Cas9技术对大豆的DME进行基因编辑,获得了dme突变体,并发现突变体种子的全基因组甲基化水平升高,同时突变体种子的百粒重与野生型相比显著增加(数据未发表),但是DME影响大豆种子发育的过程尚不明确,仍需进一步探究。表观遗传学与基因编辑技术的有机结合为改良农艺性状、加速遗传育种提供了新的手段。对于动物DNA去甲基化而言,也有一些问题需要解决。首先,TET蛋白的功能尚未在各种生物过程中得到很好的定义；其次,需要进一步研究以确定氧化的5mC,特别是5hmC,是否可以作为读取蛋白质介导生物功能的识别位点；第三,某些基因组区域对TET介导的氧化反应具有抵抗力,机体选择性保护这些区域免受氧化的机制还不完全了解；第四,TET蛋白介导的氧化反应在被动去甲基化过程中的确切作用仍有待确定；第五,大多数的研究都侧重于TET而不是TDG,但由TDG介导的修复未经修饰的胞嘧啶这一过程也尤为关键；最后,尽管成熟神经元中5hmC的含量很高,但DNA主动去甲基化在哪里发生尚不清楚。总的来讲,所有上述问题将会是完善动植物中DNA主动去甲基化机制的关键所在。