灰色关联分析丹栀逍遥散调节T2DM 胰岛抵抗主效应*

★ 许星明 谭荣荣 王晓敏*（江西中医药大学中医学院 南昌 330004）

灰色关联分析模型是近年一种成熟系统建模方法，具有需要的样本少，无典型的分布规律，计算量小等特点。其通过求因素的发展态势和系统之间的关联度来说明各个因素的变化对系统整体行为的影响程度［1］。该方法已在农业、水利、材料科学、宏观经济等多方面得到广泛应用［2-3］，但在生物系统尤其涉及调节机理的应用研究却非常少见。

丹栀逍遥散是中医学调节情志的名方［4］，由当归、白芍、茯苓、白术、柴胡、丹皮、栀子、甘草等中药组成，为针对临床肝郁血虚，内有郁热证的糖尿病合并抑郁的病机特点所立之方，其主要功效为疏肝解郁、清热［5］。

本课题组前期研究结果表明丹栀逍遥散能降低血糖、血脂、降低胰岛素抵抗，能提高外周胰岛素靶组织―肝组织胰岛素信号通路的IRS-2mRNA和PI3-KmRNA 表达，但对肝组织的AktmRNA 表达影响不大［6-7］。可能是外周胰岛素抵靶点的多样性引起，但其互相关系未见报道。因此本研究运用灰色关联模型探讨丹栀逍遥散对胰岛外周抵抗靶部位肌肉和脂肪Akt、Bcl-2、Casepase-9、Bax、ERK、Glp mRNA 六种基因对糖尿病大鼠血糖影响。

1 材料

1.1 动物 清洁级雄性SD 大鼠60 只，体重200～250 g，购自湖南斯莱克斯实验动物有限公司。动物饲养于江西中医药大学基础医学院实验动物中心。室温保持在20 ℃～25 ℃，湿度45 %～65 %，12 h 光照，12 h 黑暗。

1.2 药物及配制 柴胡6 g、当归6 g、白芍6 g、茯苓6 g、白术6 g、丹皮3 g、栀子3 g、甘草3 g。购于江西省南昌市老百姓药店，按人与动物体表面积折算法折算大鼠等效剂量为5 g/（kg·d），用5 倍于药材的冷水浸泡20 min，用武火煎至水沸，改用文火30 min，滤出药液加冷水适量，煎至水沸，改用文煎煮20 min，滤渣，将两次煎取药液混匀浓缩成每毫升含生药2 g 的药液，冰箱0 ℃～ 4 ℃保存，每周新鲜配制。

1.3 试剂与仪器 胆固醇、胆酸钠（生工生物工程（上海）有限公司）；水合氯醛（天津市福晨化学试剂厂）；盐酸二甲双胍（正大天晴药业集团股份有限公司）；罗氏活力血糖仪（Roche 公司）、罗氏活力血糖仪试纸（Roche 公司）。台式低温高速离心机CR15T（德国IKA）；SHZ-82 气浴恒温振荡器（金坛市顺华仪器公司）；微型离心机D1008E（SCILOGEX），超低温冰箱Eppendorf 410（美国Eppendorf 公司）；Aquelix 5 二级纯水仪（美国Millipore），DU730 型核酸蛋白分析仪GeneAmpPCR System2400；实时荧光定量PCR 仪Applied Biosystems StepOne； Fluor Chem M（凝 胶成像系统）（美国Protein Simple 公司）。

2 方法

2.1 动物模型建立方法和给药 SD 大鼠，给予高糖高脂乳剂灌胃（66.6 % 基础料、20 % 猪油、20 %蔗糖、10 %猪油、2.5 %胆固醇、1 %胆酸钠）1 mL/100（g·d），3 周后，禁食12 h，一次性腹腔注射STZ30 mg/kg 体重（STZ 溶于柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，所配浓度为10 mg/mL），72 h 后内眦静脉采血测定空腹血糖，筛选血糖＞11.1 mmol/L 大鼠40 只［8］。空白对照组和模型组每日以2 mL 饮用水灌胃；丹栀逍遥散高剂量组10g/（kg·d）、低剂量组5 g/（kg·d）；二甲双胍组，盐酸二甲双胍悬浊液20.8 mg/（kg·d），共8 周。

2.2 血糖 禁食12h 处死大鼠，取其血清测血糖（酶法）。

2.3 组织mRNA 的表达情况 取大鼠的肌肉组织和脂肪组织分别进行RNA 的提取，然后RT-PCR法检测Akt、Bcl-2、Casepase-9、Bax、ERK、Glp mRNA 的表达情况，并通过AlphaView SA 软件测量出灰度值。

2.4 灰色分析模型的构建［9］

2.4.1 肌肉和脂肪相关基因的RNA 表达量进行无量纲化处理 取大鼠肌肉和脂肪分别进行RNA 的提取，然后RT-PCR 检测Akt、Bcl-2、Casepase-9、Bax、ERK、Glp mRNA 的 表 达 情 况，并 通 过AlphaView SA 软件测量出灰度值，计算各自与内参比值后，采用初值化法进行无量纲化处理。以模型组为对照组，作为初值，根据X'i（k）=Xi 实际（k）/Xi模型（k）（i 为正常、二甲双胍、高剂量、低剂量组，k 为基因Akt、Bcl-2、Casepase-9、Bax、ERK、Glp）得到无量纲化数组，见表1-2。

表1 各组肌肉中相关基因RNA的无量纲化数值

表2 各组脂肪中相关基因RNA的无量纲化数值

2.4.2 计算绝对差值 逐个计算每个被评价对象指标序列（比较序列）与参考序列对应元素的绝对差值，即|X模型（k）-Xi（k）|（i 为正常、二甲双胍、高剂量、低剂量组，k 为基因Akt、Bcl-2、Casepase-9、Bax、ERK、Glp），得到绝对差值，见表3-4。

表3 各组肌肉相关目的基因的绝对差值

表4 各组脂肪相关目的基因的绝对差值

2.4.3 找出最大最小绝对差值 肌肉中最大绝对差值为0.56、最小绝对差值为0.03；脂肪中最大绝对差值为0.54 最小绝对差值为0.01。

2.4.4 计算各组关联系数和关联度 根据公式分别计算每个比较序列与参考序列对应元素的关联系数，见表5-6。

（其中X（K）为模型组的无量纲化序列，i为正常、二甲双胍、高剂量、低剂量组，k 为基因Akt、Bcl-2、Casepase-9、Bax、ERK、Glp，min为最小绝对差值，max 为最大绝对差值，ρ 为分辨系数在［0，1］之间，在这取0.5［10］。）

对各评价对象（比较序列）分别计算其个指标与参考序列对应元素的关联系数的均值，以反映各评价对象与参考序列的关联关系，并称其为关联度。

根据公式得

表5 各组肌肉中的关联系数和关联度

表6 各组脂肪的关联系数和关联度

3 结果

3.1 各组的血糖值比较 给药前，高脂饲料联合低剂量STZ 造模的各组大鼠血糖明显升高，与空白对照组比较具有显著性差异（P＜0.05）。给药后，与模型组比较，丹栀逍遥散低、高剂量组，阳性对照组对大鼠的血糖下降明显，有显著性差异（P＜0.05），见表7。

表7 各组的血糖变化的比较（）组别 n 给药前（ummol/L） 给药后（ummol/L）空白对照 8 5.5±0.7 4.8±0.7模型 7 21.0±6.1** 16.6±5.4二甲双胍 8 20.5±7.6** 10.1±4.7#高剂量 8 19.6±6.2** 12.8±5.1#低剂量 7 20.1±8.4** 12.4±5.2#与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组，#P＜0.05，##P＜0.01。

3.2 肌肉组织相关靶基因对血糖的影响和关联度 模型组为对照，肌肉组织中各组靶基因表达对血糖的影响：空白对照组0.67，二甲双胍组0.70，高剂量组0.66，低剂量组0.73。肌肉组织中相关靶基因对血糖的关联度，其中Bax、Caspase-9、Erk基因对血糖的影响比较明显。

3.3 脂肪组织各组靶基因表达对血糖的影响和关联度 空白对照组0.64，二甲双胍组0.70，高剂量组0.69，低剂量组0.65。相关靶基因对血糖的关联度，其中Bax、Caspase-9、Erk 基因对血糖的影响比较明显。

3.4 肌肉组织和脂肪组织的相关靶基因对血糖影响的关联度 具有一致性。

4 讨论

灰色关联理论是1982 年由邓聚龙创立的一门学说，将信息不完全作为灰的基本定义即：信息不完全的系统就为灰色系统。信息不完全一般是指的是：系统之间的关系不完全明确、单个系统中各因素关系不完全明确、系统结构不完全知道、系统的作用原理不完全清楚。本研究中，各个基因之间对糖尿病大鼠血糖的影响调控不明确，肌肉和脂肪两个系统之间对糖尿病大鼠血糖的影响调控不明确，完全符合灰色系统的定义，因此本研究采用了灰色关联理论分析相关基因对糖尿病大鼠血糖的调控影响，并得出了一致性的结论：外周抵抗靶部位肌肉和脂肪组织中的Bax、Caspase-9、Erk 对糖尿病大鼠血糖的调控影响大，且对血糖影响的关联度具有一致性。其中Bax、Caspase-9 属于凋亡基因，而ERK 是细胞外调节蛋白激酶属于信号通路蛋白。我们推测是否ERK 基因所在的信号通路，对凋亡基因起到调控作用，抑制胰岛细胞凋亡，从而促进胰岛素的分泌，减低糖尿病大鼠的血糖。不过他们之间是否有联系，及如何进行联系的，还需要进一步深入研究。