补肾化痰法经Sphk1通路调控肥胖PCOS雌鼠子宫内膜容受性的研究*

陈美佳，徐晓娟，黄映红，田雪梅，张 淼，熊 倩

(成都中医药大学，成都 610072)

多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是以生殖内分泌及代谢功能异常为特征的卵泡发育障碍性疾病[1]。目前，由于生活饮食习惯及环境的影响，临床发病率日益增高，育龄期妇女的发病率为5%～12%[2]，是全球卵巢性不孕的最主要疾病之一，占不排卵性不孕的50%～70%[3-5]。PCOS的西医治疗主要包括降低雄激素、促排卵、调整月经周期等方法，但疗效欠佳，临床妊娠率低于40%[6]，且早期流产率高达50%[7]。既往研究证实，PCOS高流产率与子宫内膜容受性(endometrial receptivity，ER)下降有关[8]。ER是指在种植窗口期子宫内膜允许胚胎植入的最佳容受状态，具有时效性，仅在排卵后7～8 d内局部内膜组织发生一系列改变以容受胚胎着床[9]。因此，改善PCOS不孕患者ER成为提高其妊娠率的关键问题。对PCOS患者进行中医证候分析发现，约有40%～50%的患者被辨证为肾虚痰湿证[10]，肥胖是其典型临床特征之一。本课题组认为，肾虚痰湿是肥胖PCOS的关键病机，补肾化痰法是中医治疗本病的根本治法。本研究基于Sphk1通路探讨补肾化痰法改善肥胖PCOS雌鼠ER的效应及机制,为补肾化痰法的临床运用及选方用药提供可靠的实验支持。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级SD雌鼠120只，由成都达硕生物科技有限公司提供，动物许可证SCXK[川]2015-030,体质量(180～200) g，7～8周龄适应性喂养7 d后纳入实验。室内保持每日10 h/14 h光暗交替，标准饲料喂养，自由摄食饮水，室温控制在22～25 ℃，相对湿度40%～70%，专人及时更换大鼠垫料。本实验已通过成都中医药大学实验动物伦理委员会审查。

1.2 药物制备

补肾化痰法拟方药物组成: 菟丝子30 g，覆盆子30 g，桑椹子30 g，补骨脂10 g，鹿角霜10 g，紫河车10 g，茯苓20 g，陈皮15 g，车前子15 g，肉苁蓉15 g等，统一制备药物浓度为含生药浓度5 g/ml、10 g/ml、20 g/ml的低、中和高剂量储存液，临用时稀释。二甲双胍(中美上海施贵宝制药有限公司,生产批号14030657)用法:将1片二甲双胍溶于50 ml羧甲基纤维素中，制备二甲双胍混悬液，剂量300 mg/(kg·d)。

1.3 主要试剂

雌二醇(Estradiol，E2，ELISA KIT，货号ZC-36464)、孕激素(Progesterone，PROG，ELISA KIT，货号ZC-37569)、睾酮(Testosterone，T，ELISA KIT，货号ZC-36635)试剂盒购自上海茁彩生物科技有限公司。孕激素受体(Progesterone receptor，PR)第一抗体(兔多克隆抗体，1∶150，bsm-33169 M)及雌二醇受体(Estradiol receptor，E2R)第一抗体(兔多克隆抗体，1∶300，bs-0116R)购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.4 肥胖PCOS动物模型建立

将120只雌鼠随机选取20只作为空白对照组(以下简称空白组)，其余100只雌鼠给予0.5 mg /(kg·d)浓度的来曲唑及高脂乳剂 (猪油+胆固醇，其质量比为10∶3)，灌胃体积为15 mL/(kg·d)，每日上午9点进行灌胃，连续造模28 d。造模第18天开始行阴道脱落细胞涂片观察，大鼠动情周期为5 d，镜下连续观察2个周期动情周期的阴道涂片变化，动情周期紊乱者提示造模成功，将造模成功的雌鼠纳入后续实验共计100只。

1.5 动物分组及给药

将造模成功的PCOS雌鼠100只按随机数字表法分为模型组、中药低、中、高剂量组(分别以16.65 g/kg，41.63 g/kg，83.25 g/kg中药干预，相当于70 kg成人用药等效剂量、等效剂量的2.5倍、等效剂量的5倍，以下简称低剂量组、中剂量组、高剂量组)、阳性对照组(二甲双胍300 mg/kg干预,相当于70 kg成人用药等效剂量的2.5倍)5组各20只。空白组和模型组给予等体积蒸馏水灌胃，中药各剂量组和阳性对照组给予相应药物灌胃，各组给药体积均为1 ml/100 g，连续治疗21 d后停药。

1.6 标本采集及指标检测

1.6.1 动情周期检测 自造模处理第18天起，各组大鼠每日进行阴道涂片检测，巴氏法染色，连续观察10 d。

1.6.2 体质量检测 雌鼠在适应性喂养7 d后称重为初始体质量，然后每3 d称重并记录，直到处死前称取最后1次体质量。

1.6.3 ELISA法检测血清E2、PROG及T浓度 停药后12 h各组大鼠均以10%水合氯醛按0.3 ml/100 g体积注射麻醉处死，心尖采血，4 ℃冰上静置20 min，以3500 r/min离心15 min取血清，-20 ℃保存备用。采用ELISA法检测血清E2、PROG及T浓度。

1.6.4 子宫组织病理切片染色 每组随机选择10只大鼠，取左侧子宫组织常规脱水、修剪、包埋、切片5 μm、HE染色、封片，使用BA200Digital 数码三目摄像显微摄像系统(麦克奥迪实业集团公司生产)观察，分别在×40、×100、×400下观察并采集所需图片，分析子宫组织的病理形态改变并计数腺体个数。

1.6.5 免疫组织化学法检测子宫内膜E2R、PR表达 每组选择6只大鼠，将蜡块切片、脱蜡，3%甲醇双氧水室温10 min，PBS洗3次，浸入0.01 M柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)，微波炉中高火加热至沸腾后断电，PBS洗2次，滴加山羊血清封闭液，室温20 min，滴加一抗，4 ℃过夜，滴加生物素化二抗，37℃30 min，PBS洗3次，DAB显色，苏木素复染，脱水、透明、中性树胶封片光镜下观察，以细胞质显示棕黄色均染或颗粒为阳性表达。采用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统测定阳性染色的光密度(integrated optical density，IOD)和面积(Area)，计算平均光密度值(Mean density，MD)，使用3张图像的MD计算平均数，得出E2R、PR的平均光密度值。

1.6.6 RT-PCR法检测子宫Sphk1、S1Pr1、Akt、CyclinD1的mRNA表达 表1示，每组取6只雌鼠的右侧子宫组织进行检测。TRIZOL提取子宫组织中总RNA，依次进行RNA质量检测、电泳、消化、反转录；依次用SYBR Primix Ex TaqⅡ(2×)、PCR Forward Primer(0.4 μmol/L)、PCR Reverse Primer(0.4 μmol/L)、cDNA、ddH2O试剂进行扩增40个循环，在60 ℃～95 ℃进行溶解曲线分析。使用Thermo Scientific PikoReal软件(Thermo公司)分析PCR过程各检测样本的CT值。β-actin作为内参，通过2-△△CT计算子宫组织鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase 1，Sphk1)、1型1-磷酸鞘氨醇受体(sphingosine 1-phosphate receptor 1，S1Pr1)、蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)、细胞周期蛋白1(cyclin dependent 1，CyclinD1)mRNA相对表达水平。

表1 RT-PCR检测所用引物及碱基序列

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 动情周期检测结果

图1示，阴道涂片行巴氏染色于显微镜下观察发现，模型组一直处于动情间期，动情周期失去规律性变化，而空白组处于动情期，并保持规律的动情周期。

图1 雌鼠阴道脱落细胞涂片比较(×100)

2.2 体质量与腺体数量

表2示，与空白组比较，模型组肥胖PCOS雌鼠体质量显著上升(P<0.01)，腺体个数显著下降(P<0.01)；与模型组比较，中药各组体质量显著下降(P<0.01)，腺体个数显著上升(P<0.01)。

表2 各组大鼠体质量及腺体个数比较

2.3 补肾化痰法对肥胖PCOS雌鼠血清性激素的影响

表3示，与空白组比较，模型组雌鼠血清PROG、E2浓度降低(P<0.01或P<0.05)，T浓度升高(P<0.01)；与模型组比较，高剂量组雌鼠血清PROG、E2浓度升高(P<0.05)，T浓度降低(P<0.05)。

表3 各组雌鼠血清E2、PROG、T浓度比较

2.4 子宫内膜病理形态变化

图2示，与空白组比较，模型组子宫处于发情前期, 子宫内膜较多腺上皮细胞发生空泡变性、点状坏死、细胞核固缩甚至溶解消失，且固有层见大量淋巴细胞浸润，肌层的肌纤维水肿、变性，提示模型组子宫发育滞后且子宫内膜受损；与模型组比较，中药组子宫可能处于发情期，子宫内膜明显增生，内膜变厚，固有层组织疏松水肿且见大量淋巴细胞浸润；肌层肌纤维平行排列整齐、致密，提示中药组与空白组子宫内膜发育同步，说明补肾化痰法能改善子宫内膜受损。

图2 雌鼠子宫形态HE染色比较(×400)

2.5 补肾化痰法对肥胖PCOS雌鼠子宫E2R、PR的影响

图3、4表4示，PR阳性产物主要分布在细胞浆，E2R阳性产物主要分布在细胞核和细胞浆。与空白组比较,模型组雌鼠子宫组织PR、E2R平均光密度值升高(P<0.01或P<0.05)；与模型组比较，高剂量组雌鼠子宫组织PR、E2R平均光密度值降低(P<0.05或P<0.01)。

注：A.空白组；B.模型组；C.阳性对照组；D.高剂量组；E.中剂量组；F.低剂量组图3 子宫组织E2R蛋白的免疫组化染色比较(×400)

表4 各组雌鼠子宫E2R、PR蛋白含量比较

2.6 补肾化痰法对肥胖PCOS雌鼠子宫Sphk1通路的影响

表5示，与空白组比较，模型组雌鼠子宫内膜组织中Sphk1、S1Pr1、Akt、CyclinD1mRNA表达明显降低(P<0.01)；与模型组比较，高剂量组大鼠子宫中Sphk1、S1Pr1、Akt、CyclinD1mRNA表达升高(P<0.01或P<0.05)。

表5 各组雌鼠子宫Sphk1、S1Pr1、Akt、CyclinD1mRNA表达

3 讨论

本课题基于补肾化痰法的补肾化痰拟方乃五子衍宗丸与苍附导痰汤化裁。五子衍宗丸是补肾方，能提高黄体功能，改善激素水平和子宫内膜容受性，从而提高妊娠率[11]；苍附导痰汤是治痰方，研究显示苍附导痰丸治疗肥胖型PCOS疗效显著[12]。补肾化痰拟方中菟丝子、桑椹子、覆盆子、肉苁蓉、鹿角霜、补骨脂等补肾中之阴阳，紫河车补肾精而益冲任，车前子补中有泻以防滋腻，陈皮、茯苓燥湿化痰，诸药合用补泻兼施、标本同治，可有效调经助孕。本课题组前期重点研究了卵巢颗粒细胞的增殖、凋亡与生殖性激素及糖脂代谢改变的相关性，而未涉及影响妊娠结局的重要靶器官子宫内膜。因此，本课题深入研究补肾化痰法调控肥胖PCOS子宫内膜容受性的作用机制。

肥胖可通过高雄激素、胰岛素抵抗(Insulin resistance，IR)等多种途径影响肥胖PCOS患者的生育能力，但肥胖对于PCOS子宫内膜容受性的影响机制却常常被忽视。肥胖使血糖升高产生大量胰岛素，发展成为高胰岛素血症、IR，卵巢局部的IR导致T升高。T可加速内脏脂肪分解产生更多游离脂肪酸，刺激胰腺β细胞产生更多的胰岛素，加重IR[13]形成恶性循环。高雄激素水平可促进内脏沉积脂肪，脂肪细胞也能储存雄激素样类固醇，造成脂肪组织中类固醇浓度远远高于血浆，故肥胖者的类固醇池更大[14]，说明肥胖会加重生殖内分泌紊乱。子宫内膜是性激素作用的直接靶器官，雌孕激素可以维持内膜的容受性[15]。E2、PROG的生理效应依赖E2R及PR的介导。有临床研究显示[16]，肥胖PCOS患者子宫内膜增殖期E2R、PR增多，PCOS患者长期存在无成熟卵子排出的现象，使体内E2水平变化不大，且由于缺乏PROG的拮抗作用，E2R、PR持续高表达，使子宫内膜长期在低E2作用下增生。子宫内膜是胰岛素的靶器官之一，研究显示[17]，PCOS患者子宫内膜上皮细胞胰岛素受体明显升高，提示PCOS患者子宫内膜存在局部IR。正常的葡萄糖代谢促进子宫内膜细胞的分化和成熟，载体葡萄糖转运蛋白-4(glucose transporterfactor-4，GLUT4)以胰岛素为介导转运葡萄糖，在子宫内膜腺体组织的成熟过程中起重要作用。本课题组前期课题研究[18]发现，肥胖PCOS大鼠体内GLUT4表达降低，说明其对葡萄糖的转运能力下降，子宫内膜细胞对葡萄糖的利用差，直接影响内膜糖代谢水平。

肥胖PCOS患者生殖性激素及代谢内分泌紊乱，子宫内膜无法向分泌期转化，其血管生成及螺旋化受阻，必然导致子宫内膜容受性下降，妊娠结局不良。内膜的发育少不了血管的参与，Sphk1作为一种蛋白激酶，主要存在于血管内皮细胞中，其作用是调节细胞生命活动，其周期性表达受E2R,、PR等调节。当Sphk1受到刺激后生成S1P促进血管愈合与胚胎发育，S1P与其受体S1Pr1结合活化磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/Akt通路，激活下游Cyclin D1，CyclinD1是细胞周期素家族中与细胞增殖周期关系较为密切的分子，在细胞增殖调节中起重要作用[19]。在生理条件下[20-21]，作为细胞周期调节因子，CyclinD1可以激活启动细胞周期然后联系细胞外信号环境，激活因子生长因子受体并激活多条信号通路，控制G0期过渡G1再转变S期，促进细胞增殖和子宫内膜血管生成。

本实验结果显示，模型组雌鼠动情周期失去规律，体质量明显增加，血清性激素紊乱，子宫发育滞后且子宫内膜形态受损，提示肥胖PCOS模型建立成功。模型组血清中T持续高表达，然后向E2转化被抑制，故E2含量降低。由于排卵障碍，血内PROG含量降低，说明肥胖加重生殖内分泌紊乱；模

型组PR、E2R蛋白含量明显升高，说明肥胖加重PCOS并导致子宫内膜容受性下降；Sphk1、S1Pr1、Akt、CyclinD1 mRNA表达明显降低，故推测肥胖PCOS可能上调E2R、PR表达，影响Sphk1的激活，阻碍Sphk1通路，进而影响细胞增殖、子宫内膜血管生成。经补肾化痰法干预后，中药治疗组体质量增长得到有效控制，说明补肾化痰法能改善肥胖PCOS雌鼠肥胖状态。中药高剂量组雌鼠T下降，PORG、E2上升，说明该法能调节肥胖PCOS雌鼠生殖内分泌紊乱，维持E2、PROG平衡，纠正PCOS高雄状态，使子宫处于良好的内环境中。中药高剂量组子宫组织PR、E2R蛋白含量下降，Sphk1、S1Pr1、Akt、CyclinD1 mRNA表达上升，故推测补肾化痰法通过调控E2R、PR表达，增加Sphk1表达，激活PI3K/Akt信号传导通路，上调CyclinD1表达，促进细胞增殖和子宫内膜血管生成，改善子宫内膜形态，发挥其改善子宫内膜容受性的作用。