厚朴酚对脑卒中后抑郁小鼠神经炎症及HPA轴的影响

赵欣，姬孟艳，董强

卒中后抑郁（post-stroke depression，PSD）常在卒中发生后数周至数月出现，主要表现为情绪低落和兴趣下降，严重影响患者的生活质量，死亡率及自杀率较高[1]，应及早进行干预及治疗。PSD的发病机制主要包括以下两种[2]：一是内源性机制，卒中病灶引起单胺类神经递质表达水平下降；其次是反应性机制，脑损害引起下丘脑-垂体-肾上腺（hypothalamuspituitary-adrenal，HPA）轴功能紊乱，调节障碍，进而导致PSD。厚朴酚是从木兰科植物厚朴及凹叶厚朴的干燥干皮、枝皮和根皮中提取的一种含酚羟基的活性物质，具有抗菌、抗炎、抗肿瘤、肌肉松弛等作用[3,4]。因此，本文就厚朴酚对PSD 小鼠的神经炎性因子及HPA轴的作用进行研究，探讨其在PSD中的临床应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物 厚朴酚由浙江中医药大学附属第一医院提供，盐酸氟西汀分散片（20 mg/片）购于礼来（苏州）制药有限公司，阿司匹林片（50 mg/片）购于舒泰神（北京）生物制药股份有限公司。

1.1.2 动物 健康雄性SPF级ICR小鼠，体质量25～28 g，购自上海斯莱克实验动物服务有限公司。在本院动物中心标准饲养，自由饮食，12 h/12 h昼夜节律。本研究经过浙江中医药大学动物伦理委员会批准。

1.1.3 主要仪器与试剂 全自动酶标仪、低温离心机购于美国Beckman 公司；BiometraUnio ⅡPCR 仪购于德国Biometra 公司；UV260 紫外分光光度仪购于日本Shimadzu 公司；Olympus AX70/Coolsnapfx/MetaMorph 显微图像分析系统购于日本Olympus 公司。肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6 检测试剂盒购于南京建成生物科技有限公司；促肾上腺皮质激素释放激素（corticotropin releasing hormone，CRH）试剂盒、促肾上腺皮质激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）试剂盒、皮质醇（cortisol，COR）试剂盒均由北京华英生物技术研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 模型制备 参照改良Koizumi 法[2]制作大脑中动脉栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型。10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉，颈部正中切口，钝性分离右颈总动脉（common carotid artery，CCA）主干、颈总分叉、颈外动脉（external carotid artery，ECA）和颈内动脉（internal carotid artery，ICA），结扎CCA 主干和ECA 近心端，在CCA 主干远端及ICA 根部穿线备用，用微动脉夹暂时夹闭ICA 远端，在距CCA 分叉部3～4 mm处用眼科剪剪一小口，插入线栓，使线栓从CCA顺行进入ICA，松开ICA的微动脉夹，使线栓略呈弧形，向外上方的角度缓慢顺着ICA走向插入，插入深度约为18～20 mm（从CCA分叉处计算），当线栓到达大脑中动脉（middle cerebral artery，MCA）起始段，将阻断进入MCA的血流，引起局灶性脑缺血改变。结扎CCA主干远端及ICA根部备线，防止线栓脱落，剪断多出的栓线。生理盐水清洗，消毒棉球清洁手术野，逐层缝合。注射用青霉素钠盐4万U/只腹腔注射，预防术后感染[2,3]。小鼠单笼孤养，术后恢复7 d，再给予28 d 慢性不可预见温和应激（chronic unpredictable mild stress，CUMS），包括禁食、禁水、行为限制、潮湿垫料、昼夜颠倒、倾笼、夹尾7种刺激方法，每种方法使用4次，随机分布于4个应激周期中，制作PSD模型。

1.2.2 分组 采用蔗糖水消耗实验和旷场试验行为评分，筛选出行为评分较均一的小鼠，随机分为对照组、PSD 组、阳性药物组、厚朴酚组。补充大脑中动脉栓塞后、应激中、实验过程中不可阻挡因素致死的小鼠，最终每组20 只。对照组进行MCAO 手术，但不夹闭MCA；其余3组给予MCAO造模术联合CUMS。除对照组，其余各组应激造模28 d，且于应激时给药，对照组蒸馏水灌胃，厚朴酚组给予厚朴酚灌胃，阳性药物组给予盐酸氟西汀＋阿司匹林药灌胃。给药量均为10 mL/kg，每日1次，总共28 d。

1.2.3 检测指标 造模28 d后，取出小鼠大脑，通过酶联免疫试剂盒检测TNF-α、IL-1β、IL-6的表达，放免法检测CRH、ACTH、CORH表达水平。

1.3 统计学处理

采用SPSS21.0 统计软件分析数据，计量资料以（±s）表示，单因素方差分析，LSD多重比较检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠体重变化比较

造模前1 d、造模第21 天、第28 天，对照组、PSD 组、阳性药物组、厚朴酚组4组体质量组间比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 各组小鼠体质量变化比较（g，±s）

表1 各组小鼠体质量变化比较（g，±s）

组别对照组PSD组阳性药物组厚朴酚组只数20 20 20 20造模前1 d 25.64±1.21 25.13±2.13 25.41±1.34 25.64±2.17造模第21天26.34±2.12 27.89±1.34 29.14±3.12 27.16±3.11造模第28天28.21±1.02 29.31±2.15 28.33±1.22 29.88±1.02

2.2 各组炎性因子表达比较

与对照组相比，PSD 组小鼠脑IL-1β、IL-6、TNF-α表达明显增加（P＜0.05），阳性药物组和厚朴酚组的小鼠IL-1β、IL-6、TNF-α表达下降（P＜0.05），阳性药物组和厚朴酚组相比上述3个指标差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 各组小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL6比较（±s）

表2 各组小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL6比较（±s）

注：与对照组相比，①P＜0.05；与PSD组相比，②P＜0.05

组别对照组PSD组阳性药物组厚朴酚组只数20 20 20 20 TNF-α 2.1±0.6 3.3±0.7①2.5±0.6①②2.7±0.4①②IL-1β 1.4±0.6 2.8±0.6①2.4±0.5①②2.3±0.4①②IL6 1.5±0.4 3.3±0.6①2.2±0.5①②2.4±0.8①②

2.3 HPA轴相应激素的变化

与对照组相比，PSD 组、阳性药物组、厚朴酚组的CRH、ACTH、肾上腺及血清CORT明显上升（P＜0.05）；与PSD组相比，阳性药物组、厚朴酚组的CRH、ACTH、肾上腺及血清CORT明显下降（P＜0.05）；与阳性药物组相比，厚朴酚组的CRH、ACTH、肾上腺及血清CORT表达水平差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

表3 各组小鼠HPA相关激素含量比较（±s）

表3 各组小鼠HPA相关激素含量比较（±s）

注：与对照组相比，①P＜0.05；与PSD组相比，②P＜0.05

组别对照组PSD组阳性药物组厚朴酚组只数20 20 20 20 CRH/(ng/mL)0.80±0.29 1.16±0.22①0.97±0.31①②0.88±0.26①②ACTH/(pg/mL)3.69±0.25 4.85±0.68①4.78±0.25①②4.72±0.15①②组别对照组PSD组阳性药物组厚朴酚组肾上腺CORT/(ng/mL)27.15±5.78 42.82±5.64①31.52±4.16①②29.43±4.35①②血清COR/(ng/mL)235.42±8.67 275.18±24.31①265.20±9.75①②255.30±8.46①②

3 讨论

PSD是指脑卒中后发生的情绪低落，疲乏无力，失眠多梦，是一种常见的继发性抑郁，发病率约为18%～78%[5]。越来越多的研究发现，炎症通路和炎症介质与抑郁症的发生发展密切相关。神经炎性反应是由神经胶质细胞和巨噬细胞产生的多种炎性反应因子导致的细胞和组织损伤，最终导致神经元凋亡和坏死，加剧病情进展。缺血引起的神经元死亡激活了缺血区域的免疫运输并导致大脑和外周免疫功能的转变。脑梗死时，外周血免疫细胞通过受损的血脑屏障迁移至梗死部位，分泌多种炎症因子、促炎介质，产生免疫反应[6]。同时，这些炎性因子产生级联放大反应，引起机体功能障碍和氧化应激[7]。炎症在抑郁症发生中起重要作用。首先，抑郁样行为在感染动物中很常见。其次，情绪障碍常在感染后出现。使用促炎细胞因子治疗的患者往往会发展为抑郁症。炎症在PSD的发生中至关重要，其可作为PSD 的一个治疗靶点，而与二甲双胍相比，吡格列酮治疗可减少糖尿病患者的PSD。因吡格列酮具有抗炎和神经保护的作用。最近的继发性脑卒中预防试验中，吡格列酮降低胰岛素抵抗患者的CRP。这提示脑卒中后免疫反应的抑制可以预防PSD的发生。

HPA轴的功能与PSD的发生发展密切相关。生理情况下，HPA 轴可维持内环境的稳定，参与人体行为、情绪的协调以适应外界压力、刺激等的变化[8,9]。下丘脑控制中枢神经内分泌功能，是中枢神经系统与身体其他部位之间的主要中介。陈宇等[10]发现PSD患者体内HPA轴负反馈中枢海马明显减小，并有研究发现抑郁症早期患者左侧海马体积较健康人下降[11]。可见，PSD与HPA轴功能异常密切相关。卒中后常出现应激反应，引起COR和儿茶酚胺水平升高。脑卒中后肾上腺水平的HPA轴异常可能在卒中后早期发生，并与预后相关。PSD患者HPA轴兴奋，引起体内谷氨酸升高及γ-氨基丁酸降低，进而神经细胞损伤增加，恢复减弱，从而形成恶性循环。运动训练作为康复治疗的常见方法，广泛应用在临床的各项治疗中。既往研究发现运动训练可降低HPA 轴的兴奋作用，加大调节能力，促进PSD 患者病情的恢复。吴奇勇等[12]对PSD患者进行精细动作训练，发现其对PSD 患者的康复具有促进作用。抑郁患者中由HPA 轴产生的炎症和促炎症因子表达升高[13]，可激活HPA轴，产生正反馈，改变神经传导。炎症反应改变机体的内分泌功能，降低单胺类神经递质的水平，进而导致PSD[14]。

厚朴酚是中草药厚朴的主要活性成分，具有抗免疫、抗氧化、镇痛消炎等作用。本研究发现厚朴酚能有效抑制脑内神经胶质细胞的激活，降低应激对HPA 轴产生的刺激作用，减少炎性因子等的表达，改善PSD 小鼠体内神经炎性反应，为PSD 的临床治疗提供了新的思路。本研究中，阳性药物组与厚朴酚组较PSD组，出现IL-1β、IL-6等炎症因子表达下降，阳性药物组与厚朴酚组则无明显差异，提示厚朴酚与阿司匹林及氟西汀均可降低小鼠体内的炎症反应，具有抗炎的作用。与对照组相比，PSD组、阳性药物组、厚朴酚组的CRH、ACTH、肾上腺及血清CORT明显上升，提示PSD引起的应激可导致HPA轴兴奋，并引起相应激素水平升高。与PSD组相比，阳性药物组、厚朴酚组的CRH、ACTH、肾上腺及血清CORT明显下降，与阳性药物组相比，厚朴酚组的CRH、ACTH、肾上腺及血清CORT表达水平对比无明显差异，提示厚朴酚同阿司匹林及氟西汀一样，也可调节HPA 轴的功能，降低PSD 对小鼠HPA 轴的刺激，有利于病情的恢复。本研究也存在一些局限性。本研究样本量较小，所得结果难免存在误差；测量指标较少，难免存在偏倚。未来期待大样本量、更精确的测量仪器及指标使结果更具可靠性。