一种山黄麻丛枝病的分子检测与鉴定

万琼莲，苏 帆，许杏萍，蔡 红，王连春

(1.玉溪师范学院 化学生物与环境学院，云南 玉溪 653100; 2.云南农业大学 农业生物多样性与病虫害控制教育部重点实验室，云南 昆明 650201)

植原体(phytoplasma)属细菌界柔膜菌纲、植原体候选属，是目前发现最小的细菌.植原体病害侵染常引起植物产生丛枝、矮化、黄化、花变绿、花变叶、巨芽、畸形等症状.该病害对农林业生产造成严重损失，迄今世界各地报道的植原体病害已有1 000多种[1].植原体由于不能体外培养，因此常采用分子鉴定的方法进行检测或进行基因克隆和测序[2～8].

本研究中所采集的样品属于榆科山黄麻属(TremaLour.)植物，其形态与该属中的羽脉山黄麻(TremalevigataHand-Mazz.)最为接近.山黄麻为乔木或灌木，叶互生，生长在热带和亚热带，在云南广泛分布，具有生态价值，属绿化先锋物种[9,10].本研究针对植原体的保守基因(16S rRNA)采用分子生物学方法对云南省峨山县采集到的表现为丛枝、小叶和黄化典型症状的感病植株进行检测鉴定，以明确病原及其株系的分类地位，为该病害的深入研究和防治提供材料和基础.

1 材料与方法

1.1 样品的来源

样品采自云南省玉溪市峨山县表现为典型丛枝、小叶、黄化症状的山黄麻感病植株，海拔400 m.

1.2 总DNA的提取、PCR扩增、克隆及测序

参照“百泰克”新型快速植物基因组DNA(目录号:DP3112)提取试剂盒方法提取植株总DNA，将提取的DNA置于-20℃下保存备用.针对16S rDNA采用植原体通用引物P1 /P7 和R16F2n /R16R2[11,12]进行巢式PCR 扩增(引物由云南农业大学蔡红教授提供).在紫外透射仪上切取大小正确的目的片段，用植物基因组DNA纯化试剂盒(昆明硕阳)纯化回收，与pMD19-T ( TaKaRa) 载体连接转化到大肠杆菌DH5α中，采用PCR反应筛选出阳性克隆后送至上海铂尚生物技术有限公司进行测序.PCR反应条件：每次反应前DNA稀释25倍，直接PCR，94℃预处理5 min；94℃ 1 min，48℃ 1 min，72℃ 2 min，30个循环；72℃延伸10 min.巢式PCR，95℃预处理5 min；95℃ 30 S，55℃ l min，72℃ l min 30 S，35个循环；72℃延伸10 min.

表1 植原体16S rDNA的通用引物

1.3 序列分析和进化树的构建

将测序所得序列录入GenBank进行BLAST比对，确定是否为植原体.通过植原体在线分类鉴定工具iPhyClassifier(http://plantpathology.ba.ars.usda.gov/cgi-bin/resource/iphyclassifier.cgi)针对16S rDNA F2nR2片段进行相关候选种的确定，得出虚拟RFLP图谱及相似系数(similarity coefficient，F)，确定16Sr组/亚组.用MEGA软件采用邻接法(neighbor-joining method)进行植原体候选种和16Sr I组(Candidatus Phytoplasma asteris)不同亚组成员的进化树构建，以1 000为重复值进行Bootstrap校验，用在线工具MUSCLE(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/#)进行多序列比对和组内进化树构建，得出序列同源性，分析亲缘关系的远近.

2 结果与分析

2.1 感病植株的症状及16S rDNA片段PCR扩增结果

感病植株与健康植株相比症状明显表现为丛枝、小叶和黄化，丛枝处枝条密集丛生，远看呈“鸟窝状”，同时伴有节间缩短，叶片卷曲变小.有些树丛枝多而密集且整株枯死(图1).其中，图1-A:健康枝叶；图1-B:健康和丛枝对照.从感病植株中提取总DNA进行直接PCR和巢式PCR扩增，经1%的琼脂糖凝胶电泳后获得大小约1 200 kb 的16S rDNA 片段(图2).

图1 山黄麻丛枝病症状图 图2 PCR产物琼脂糖凝胶电泳

2.2 16S rDNA序列分析和系统进化树构建

将扩增得到的约1 200 bp大小的特异性片段进行割胶纯化、克隆和测序，结果表明16S rDNA 扩增片段含1 246个核苷酸，G + C 含量为47.11 % ，符合植原体基因组G + C含量特征(图3).利用数据库GenBank 的BLAST程序对16S rDNA进行同源检索发现该序列为植原体，将此片段命名为山黄麻丛枝植原体(Tremawitches’-broom phytoplasma，SHMWB-ES).

图3 山黄麻丛枝植原体16S rDNA片段(箭头表示引物序列)

通过MUSCLE进行多序列比对发现，山黄麻丛枝植原体(SHMWB-ES)与翠菊黄化植原体组(CandidatusPhytoplasma asteris，16Sr I组)部分成员同源性几乎都在99%以上，其中与16Sr I-B亚组的菌株Bougainvillea proliferation(BSP-Br1，EU423898)和16Sr I-X亚组的Trema levigata witches’-broom(TLWBYN01，MN513329)同源性最高，分别为99.76%和99.84%，其次是和16Sr I-M亚组的Aster yellows (AVUT，AY265209)以及16Sr I-B亚组的Oenothera virescence(OAY，M30790)同源性达99.6%，与16Sr I-D亚组的Paulownia witches’-broom(PaWB，AY265206)是99.52%(表2).通过iPhyClassifier植原体在线分类鉴定工具分析表明该植原体与翠菊黄化植原体(CandidatusPhytoplasma asteris)相关，与该组参考株系(M30790)的序列相似性为99.6%，属16S rI组成员，SHMWB-ES的F2nR2片段的17种限制性内切酶的虚拟RFLP模型(图3)与16Sr I-B亚组的参考模型(AP006628)最为相似，相似系数F为0.96，因此该植原体可能是16S rI组的一个新成员.

利用MEGA 5.1软件构建山黄麻丛枝植原体(SHMWB-ES)和已被正式描述的31个候选种(Ca. Phytoplasma) 的16S rDNA系统进化树(图4)，SHMWB-ES与植原体16Sr I组成员明显聚为一个的类群，表明该植原体属于翠菊黄化植原体组(16Sr I组).山黄麻属榆科植物，本研究所得结果与已报道的榆科榆属相关植原体16Sr V-A亚组代表成员Ca.P.ulmi(EY1，AY197655)明显不在一支.通过MUSCLE在线分析工具构建SHMWB-ES与21个16S rI组内成员的系统进化树表明SHMWB-ES在16Sr I组成员中与16Sr I-B亚组的菌株BSP-Br1(EU423898)、16Sr I-X亚组的TLWBYN01(MN513329)、BG01(LT594117)、BG02(LT594118)菌株亲缘关系更近.

图5 SHMWB-ES与31个植原体候选种的16S rDNA系统进化树

图6 SHMWB-ES与21个16S rI组成员的 16S rDNA 系统进化树

3 结论和讨论

植原体侵染植株后可引起典型的丛枝症状，例如泡桐丛枝病[13]和枣疯病[14]，其中翠菊黄化植原体组(CandidatusPhytoplasma asteris，16Sr I组)是植原体最大的组，在全世界范围内分布较为广泛，组内植原体变化也最大[15].本研究通过采集在云南省峨山县发现的呈现典型丛枝症状山黄麻感病植株进行植原体分子检测，以确定其病害的发生是否与植原体相关.结果表明山黄麻丛枝中确实存在植原体，通过分类鉴定也进一步得出山黄麻丛枝植原体(Tremawitches’-broom phytoplasma，SHMWB-ES)属于翠菊黄化植原体组(16Sr I组)成员，与16Sr I-B亚组和16Sr I-X亚组的亲缘关系较近，虽然SHMWB-ES的F2nR2片段RFLP模型与16Sr I-B亚组的参考模型(AP006628)最为相似，但相似系数F仅为0.96，未达到0.97以上[16]，因此本研究中山黄麻丛枝植原体可能是16Sr I组中的新成员，对于在该组中的亚组地位还有待进一步分析.目前，植原体的分类主要基于16S rRNA 基因序列，有的结合核糖体蛋白基因(rp) 、分泌蛋白基因(SecY) 及延伸因子(tuf) 等进行分析.为了更客观的对山黄麻丛枝植原体进行分类鉴定，下一步可采用多位点序列分析法(Multilocus Sequence Analysis)[17]对该植原体的多个保守基因进行联合分析.

本研究中的山黄麻为榆科山黄麻属植物，其形态特征与该属中羽脉山黄麻最为接近，但在调查期间，该植株还未开花结果，因此对于该植原体寄主的种类还需进一步确认.已报道的榆科榆树黄化植原体为16Sr V-A亚组[18,19]，有关榆科山黄麻属植物植原体病害的报道较少，目前只有在云南省新平县发现的羽脉山黄麻植原体(MN513329)，且本研究中的植原体与上述植原体并不一样，但是存在较高的同源性，说明植原体在山黄麻属植物中是有变异的，但他们又同属于16Sr I组，山黄麻在云南分布较多，这一发现说明还有很多地区的山黄麻可能存在植原体，这需要进一步的调查和研究.此外，本次调查发现，有几棵丛枝症状比较严重的山黄麻已经枯死，说明发病严重有可能会导致植株的死亡，因此对山黄麻丛枝病应引起足够重视，并采取措施进行防治.