水母胶原蛋白的提取及性能研究

仇雷雷，王 博，邹帅军，王倩倩，张黎明 （海军军医大学海军特色医学中心海洋生物医药与极地医学研究室，上海200433）

0 引言

胶原蛋白主要存在于动物皮肤、骨骼和结缔组织中，是主要的结构蛋白质。胶原蛋白具有较低的免疫原性、较好的生物相容性、良好的生物降解性等生物学优点，广泛应用于生物制药、医疗保健、组织工程、食品加工、美容化妆品等领域。目前胶原蛋白主要来源于陆生牲畜（牛、羊和猪等），但某些疾病（口蹄疫、疯牛病）以及宗教相关问题，使得这些牲畜来源的胶原蛋白应用受到一定约束[1]。海洋来源的胶原蛋白资源丰富，且不存在传染性病菌和伦理等问题，因而，对海洋生物来源的胶原蛋白进行开发利用具有良好的应用前景[2]。

目前，从海洋生物提取胶原蛋白的研究主要集中在鳕鱼、罗非鱼、海参以及水母等，这些海洋生物的皮肤、肌肉、软骨组织及中胶层等部位中含有丰富的胶原蛋白[3]。水母是一类胶质状的浮游生物，属刺胞动物门，种类多，分布广，我国近海海域水母资源丰富。大型水母伞部直径可达2 m，中胶层非常厚实，其中胶原蛋白（122.64～693.92 mg/g，干重）约占总蛋白含量的50%[4]。本研究选用青岛海域采集的越前水母（Nemopilema nomurai），对其伞部胶原蛋白进行分离纯化和表征，为水母胶原蛋白的开发应用提供理论基础。

1 材料与仪器

1.1 仪器

SCIENTZ-12N 冷冻干燥机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；LA8080 氨基酸自动分析仪（日本株式会社日立高新技术科学）；Nicolet iS50 傅里叶变换红外光谱仪（美国Thermo Scientific 公司）；X′Pert3 Powder X 射线衍射仪（荷兰帕纳科公司）；VARIOSKAN LUX 多功能酶标仪（美国Thermo Scientific 公 司）；Mini-PROTEAN Tetra System 垂直电泳系统（美国BIO-RAD 公司）。

1.2 试剂

越前水母样品采集于青岛海域，腌制后于-20 ℃保存；牛I 型胶原蛋白标准品（河北考力森公司）；胃蛋白酶（上海生工生物工程公司）；标准蛋白Marker（日本TaKaRa 公司）；其余试剂均为国产分析纯。

2 实验方法

2.1 胶原蛋白的提取与纯化

提取：经腌制的水母样品用自来水清洗，去除表面盐分，4 ℃下用去离子水浸泡、洗净后，再用异丙醇去除脂肪、NaOH 去除杂蛋白、过氧化氢去除色素。称取去杂水母伞盖样品，组织匀浆后加入相应体积不同浓度（0.3～0.6 mol/L）的乙酸溶液，胃蛋白酶的添加量为水母伞盖质量的0.1%～0.5%，酶消化时间为24～96 h，反应后的液体使用200 目网过滤，离心（4 ℃，10 000 r/min）30 min 取上清即得粗提液。

纯化：①超滤：分别取粗提液5 ml 至分子量10 万和 5 万的超滤管中，4 ℃ 离心（4 000 r/min，30 min），收集滤液进行SDS-PAGE 分析。②透析：分别取粗提液5 ml 到分子量5 万和10 万的透析袋中，4 ℃透析3 d，每8 h 换一次透析液，取样进行电泳分析。③盐析：取粗提液5 ml，添加NaCl 至浓度为 0.9 mol/L，4 ℃ 下 10 000 r/min 离心 10 min，收集沉淀，复溶于0.5 mol/L 乙酸溶液，重复上述过程2 次，取溶液进行电泳分析。仅改变NaCl 浓度（0.9 mol/L→0.9 mol/L→2.0 mol/L 或 2.0 mol/L→0.9 mol/L→0.9 mol/L），重复实验。

粗提液纯化后，在-80 ℃冷冻干燥得水母酶溶性胶原蛋白（PSC）。

2.2 单因素分析和正交实验设计

以水母胶原蛋白得率（冻干胶原蛋白质量/水母干重）为指标，确定基本反应条件（乙酸浓度、料液比、胃蛋白酶用量、提取时间），每次改变其中一个条件进行水母胶原蛋白提取的单因素实验。

获得单因素数据后，设计正交实验（表1）来获取最佳的实验方案。

表1 水母胶原蛋白提取正交实验因素水平表

2.3 天狼星红法测定胶原蛋白浓度

参照Coentro 等[5]的方法检测胶原蛋白浓度，将100 μl 胶原蛋白溶液添加至1 ml 天狼星红色染料中静置30 min，然后以12 000 r/min 离心30 min。去除上清，沉淀用碱性试剂溶解30 min，取200 μl胶原蛋白液于540 nm 处读数。

2.4 X 射线衍射

用X 射线衍射仪分析胶原蛋白样品的晶体结构，X 射线源为 Cu 靶 Ka 辐射（λ=0.154 nm），电流为 40 mA，电压为 40 kV。扫描角度 2θ 为 5°～40°，扫描速率为 3.6°/min，并根据公式 λ=2d sinθ，计算d 值。

2.5 紫外光谱分析

胶原蛋白溶解于0.5 mol/L 乙酸中，用多功能酶标仪检测其紫外光谱。扫描波段为200～400 nm，波长间隔为1 nm。以0.5 mol/L 乙酸溶液作为空白对照。

2.6 傅里叶变换红外光谱分析

取胶原蛋白5 mg 和适量KBr 置于研钵中，研磨均匀。取适量的混合样品于压片磨具中，用压片机制成试样薄片。将压片放入傅里叶变换红外光谱仪内进行扫描（500～4 000 cm-1，分辨率 2 cm-1）。

2.7 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）

胶原蛋白溶液和上样缓冲液混匀后水浴（100 ℃）加热 5 min，取 15 μl 上样，使用 8% 的分离胶和5%的浓缩胶，80 V 电泳100 min。

2.8 氨基酸组成分析

胶原蛋白样品在110 ℃下盐酸水解24 h，水解产物12 000 r/min 离心20 min，上清液用氨基酸自动分析仪进行氨基酸含量测定。

本文采用MIDAS-GTSNX岩土有限元软件来模拟双排水盲沟的渗流计算。一般计算模型如图2所示。计算时，在模型两侧以及排水盲沟处设置给定水头边界；在模型底面、顶面，以及排水盲沟上的开挖面设置给定流量边界，流量为0，即为隔水边界。

2.9 胶原蛋白的溶解性

将胶原蛋白样品溶于0.5 mol/L 乙酸溶液中，配成1 mg/ml 的胶原蛋白溶液，分别取10 ml 溶液调配成不同 pH 值（3～9 共 7 个梯度）和 NaCl 浓度（0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1 mol/L），10 000 r/min离心，取上清液进行胶原蛋白浓度测定，并绘制变化曲线。

2.10 数据处理

3 结果与分析

3.1 胶原蛋白提取的单因素结果

从图1A 可见，当酶的用量从0.1%升到0.3%时，胶原蛋白得率逐渐增高并达到最大值。继续增加酶使用量，胶原蛋白得率反而减少，可能是过量酶对胶原蛋白具有一定破坏作用。从图1B 可见，当乙酸浓度为0.4 mol/L 时，胶原蛋白的得率最高。而乙酸过量，会破坏已生成胶原蛋白。从图1C可见，料液比在1∶2 g/ml 时，水母胶原蛋白的得率最大。可能是料液比低于1∶2 g/ml 时，胶原溶胀不充分，而料液比继续增加并没有多余胶原以供溶胀。从图1D 可见，随着时间推移，胶原蛋白的得率先升高再下降：48 h 和24 h 相比，增加了8.8%；72 h和 48 h 相比，增加了 15.9%；96 h 和 72 h 相比，得率反而下降，说明72 h 是胶原蛋白提取的最佳时间点。

3.2 胶原蛋白提取的正交实验

表 2 正交实验极差 R 分析中，RA＞RD＞RC＞RB，即在胶原蛋白提取中，酶的使用量起着最关键的作用，提取时间排第二，料液比和乙酸浓度的影响比较小。综合这9 组数据，确定最优理论水平为A3B2C2D3，即乙酸（0.4 mol/L）、料液比（1∶2 g/ml）、胃蛋白酶（0.3%），提取 72 h，此时的得率为（33±0.63）%。

3.3 胶原蛋白的纯化

图2 中水母胶原蛋白粗提物（泳道8）在分子量13 万处含有大量的目标胶原蛋白，分子量10 万以下有杂条带。不同规格透析袋处理（泳道1、2）后，分子量10 万以下的杂蛋白部分去除；盐析结果显示，0.9 mol/L→0.9 mol/L→2.0 mol/L NaCl 的盐析（泳道4）可以去除大量杂蛋白，但目标蛋白损失较多，而 0.9 mol/L→0.9 mol/L→0.9 mol/L NaCl（泳道3）处理既可以保留目标蛋白又能够去除部分杂蛋白。最后超滤结果显示，分子量10 万（泳道6）的超滤管可以明显减少杂蛋白含量。

3.4 SDS-PAGE 电泳分析

图1 水母胶原蛋白提取的单因素分析

表2 水母胶原蛋白提取正交实验结果

图2 水母胶原蛋白纯化过程 SDS-PAGE 电泳图

纯化实验结果提示，单一纯化方法不能完全去除杂蛋白，传统透析处理耗时长，而反复盐析会增加胶原蛋白溶液NaCl 含量。综合权衡后确定纯化条件为0.9 mol/L→0.9 mol/L→0.9 mol/L NaCl 盐析和100 kDa 超滤组合。图3 是组合纯化后胶原蛋白电泳图：泳道b 为牛I 型胶原蛋白标准品，在分子量 13 万左右有 α1、α2链，而 β 链 γ 链的分子量都在20 万以上。本实验提取的水母胶原蛋白（泳道a），分子量10 万下基本没有杂蛋白，但α 链只发现了一条，其分子可能是(α1)3[6-7]，分子量在13 万左右，符合I 型胶原蛋白的特征。

图3 纯化后水母胶原蛋白 SDS-PAGE 电泳图

3.5 胶原蛋白的X 射线衍射图

胶原蛋白X 射线衍射分析结果如图4、表3 所示。水母胶原蛋白和牛胶原蛋白都有3 个衍射峰。峰1 形状尖锐与胶原蛋白三螺旋结构有关，d 值反映胶原蛋白分子链间距离[8]，水母和牛胶原蛋白的d1值分别为 1.244 nm 和 1.226 nm。在20°附近出现一个宽大峰（峰2），代表胶原蛋白纤维内部众多结构层次所引起的漫散射[9]。在30°附近出现了第3 个峰（峰3），该峰较小，其d 值显示三股螺旋结构中沿螺旋中心轴相邻氨基酸残基之间的距离[10]，水母和牛胶原蛋白峰3 的d3值分别为0.295 nm 和0.296 nm，极为接近。说明水母胶原蛋白和牛胶原蛋白标准品一样，保持了完整的三股螺旋结构。

3.6 胶原蛋白的紫外吸收光谱

蛋白通常含有芳香族氨基酸酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸，这些氨基酸含有苯环共轭双键系统，在特定波长（280 nm 和251 nm）处有最大吸收峰。但在胶原蛋白中这些氨基酸含量少，其紫外吸收峰主要集中在220～230 nm，主要是由羰基C=O 的n→π跃迁所致。水母胶原蛋白的紫外光谱如图5 所示，其最强吸收峰在220 nm 处，与牛胶原蛋白吸收峰出现的位置类似，接近Ab Aziz 等[11]报道的水母Rhopilema hispidum 胶原蛋白紫外吸收峰（218 nm），提示本实验中提取的水母胶原蛋白纯度较高。

3.7 胶原蛋白的傅里叶变换红外光谱

图4 胶原蛋白的 X 射线衍射图谱

表3 胶原蛋白 X 射线衍射峰对应的 d 值

从图6 可见，水母胶原蛋白酰胺A 吸收峰为3 288 cm-1，和 Rastian 等[12]检测的酰胺 A（3 292 cm-1）吸收峰接近，表明氢键存在于胶原蛋白结构中。胶原蛋白分子中CH2基团的不对称伸缩振动产生了酰胺B 特征吸收峰[13-14]，水母胶原蛋白的酰胺B 在2 933 cm-1处，和牛胶原蛋白的酰胺 B（2 936 cm-1）吸收峰类似。作为蛋白质二级结构变化的特征区域——酰胺Ⅰ带（1 625～1 690 cm-1），是由蛋白质肽链骨架的C=O 伸缩振动产生[15]，水母胶原蛋白的酰胺I 带出现在1 641 cm-1。水母胶原蛋白酰胺II 带吸收峰出现在1 543 cm-1，在胶原蛋白酰胺II 带（1 500～1 600 cm-1）的范围内，可能是 C—N 键的伸缩振动和N—H 弯曲振动产生。水母胶原蛋白酰胺Ш位于1 236 cm-1处，主要是脯氨酸侧链和甘氨酸骨架的—CH2摇摆振动产生，提示所提取的水母胶原蛋白三螺旋结构完整性较好。

图6 胶原蛋白的红外光谱

图5 胶原蛋白紫外光谱

3.8 天狼星红法检测胶原蛋白

电泳图谱表明提取的水母胶原蛋白达到电泳纯（95%）。文献报道[16-18]天狼星红染料与胶原蛋白中的特征性结构Gly-X-Y 结合，可以使用天狼星红染料对胶原蛋白进行快速检测。本实验测得每100 mg 冻干的水母胶原蛋白样品中含有胶原蛋白96.85 mg，其纯度为96.85%。

3.9 氨基酸组成分析

如表4 所示，水母胶原蛋白的氨基酸组成中，甘氨酸占34.8%，与云南深水鲷鱼皮胶原蛋白甘氨酸含量（35%）接近，比热带淡水鲤鱼鳞中胶原蛋白甘氨酸含量（30.6%）高[19]。水母的胶原蛋白中羟脯氨酸占6.3%，脯氨酸占8.2%，亚氨酸比例为14.5%。其脯氨酸羟基化度（羟脯氨酸含量/亚氨酸含量）为43.68%，比牛胶原蛋白标准品的羟基化度（39.92%）和Zhang 等[7]提取的水母胶原蛋白的羟基化度（32.2%）都高。据文献报道[20]，羟基化度越高，胶原蛋白的三螺旋结构越稳定。检测结果中还发现蛋氨酸、酪氨酸和组氨酸的含量比较低，缺乏色氨酸，这些都符合I 型胶原蛋白的特点[21]。

3.10 胶原蛋白的溶解性

从图7A 可见，当NaCl 浓度在0.5～0.8 mol/L时，水母胶原蛋白相对溶解度比较稳定，保持着最大值。其原因可能是低浓度的盐离子可以与胶原蛋白分子结合，使得胶原蛋白分子带有更多的电荷，相互排斥，溶解度较大。当NaCl 浓度达到0.9 mol/L时，水母胶原蛋白的溶解度急剧下降，相对溶解度不到23%，当NaCl 浓度超过1.0 mol/L 后，其相对溶解度在15%左右。可能因为NaCl 的浓度较高时，极性较强的盐离子夺走了胶原蛋白结合的水分子，破坏了其周围的水化膜，盐析作用显现出来，溶解度下降。

表4 二种胶原蛋白中不同氨基酸组分的百分比

从图7B 可见，当溶液的pH 在3～5 时，水母胶原蛋白的相对溶解度比较大，维持在80%左右。其中pH 为4 时，溶解度最大，与海参胶原蛋白的溶解性类似[3]。当pH 在6～8 时，胶原蛋白的相对溶解度维持在较低值，尤以pH 7 时溶解度最小，此时就是胶原蛋白的等电点。当pH 超过8 后，胶原蛋白溶液的溶解度又有所上升。

4 讨论

图7 水母胶原蛋白在不同 pH 值及NaCl 浓度条件下溶解度特性

本实验通过单因素分析和正交实验优化了水母胶原蛋白的提取条件，确定最适条件为：乙酸0.4 mol/L、料液比1∶2 g/mL、胃蛋白酶0.3%、反应72 h。水母胶原蛋白的纯化方法优化为0.9 mol/L-0.9 mol/L-0.9 mol/L NaCl 盐析和分子量10 万超滤的组合方法。相比阳离子交换层析法和Sephacryl S-100 凝胶过滤纯化方法，超滤不仅可以去除盐分和杂蛋白，还能快速富集胶原蛋白，缩短提取时间。

纯化的水母胶原蛋白通过天狼星红法检测其纯度为97%，高于从其他多种海洋生物提取的I 型胶原蛋白纯度[22-23]。本实验中越前水母胶原蛋白干重得率为33% 左右，相比于水母Chrysaora quinquecirrha 胶原蛋白提取得率（1.2%干重）显著提高[24]。凝胶电泳显示提取的水母胶原蛋白构型可能是 (α1)3，α1链分子量约为 13 万和 10 万以下基本没有杂条带，比Jankangram 等[25]提取的水母胶原蛋白纯度更高。在氨基酸组成分析中，越前水母胶原蛋白甘氨酸占34.82%，羟脯氨酸占6.33%，脯氨酸占8.16%，没有检测到色氨酸。以上结果均表明水母胶原蛋白符合I 型胶原蛋白的特点。光谱分析发现，分离纯化过程中水母胶原蛋白三螺旋结构保存较好。溶解度试验表明其在pH=4 时溶解性最佳，当NaCl 浓度升高至0.9 mol/L 时溶解度快速下降。

总之，本研究通过优化提取纯化过程，缩短了水母胶原蛋白制备时间，提高了所得胶原蛋白的纯度，且水母胶原蛋白三螺旋结构保持完整，与牛I 型胶原蛋白特征相似度很高，提示水母胶原蛋白可望成为哺乳动物胶原蛋白的替代品。鉴于水母胶原蛋白具有资源丰富、提取方便、生物相容性好等优点，可望成为生物医药、食品、化妆品等多领域的理想生物材料，具有良好的应用前景。