不同采收期对月季花总黄酮含量及其抗氧化活性的影响

上官琨瑶,黄秀秀,宋 庸,张晓婷,潘 斐,刘怡晨,蒋万里,钱慧琴

(新乡医学院三全学院,河南新乡 453000)

月季花(Rosae Chinensis Flos)是蔷薇科蔷薇属月季(RosachinensisJacq)的干燥花。味甘,性温,归肝经,具有活血调经,疏肝解郁之效,临床上常用于气滞血瘀,月经不调,痛经,闭经,胸胁胀痛等病症的治疗[1],亦可用于冠状动脉性心脏病、颈淋巴结炎、肺虚咳嗽咯血、产后阴挺等病症的治疗[2]。研究发现,月季花活性成分有黄酮类、酚酸类、芳香油、鞣质和色素[3-4]等,其中,以黄酮类化合物中槲皮素及其苷类为其主要活性成分[5-6],具有抗氧化[7-9],抗肿瘤[10-11],抗菌[12],抗衰老[13],提高机体免疫[14]等作用[15-16]。

黄酮类化合物是药用植物体内的次生代谢产物,不同采收期与其次生代谢产物的积累有密切联系[17]。药材能否发挥较好的临床疗效以及评价其质量的好坏主要取决于其活性成分[18]。目前,薛紫鲸等[19]采用紫外-可见分光光度法测定不同采收期祁艾的总黄酮和总酚酸含量,发现祁艾在不同采收期内黄酮和酚酸的含量有较大的差异,经过分析发现端午节前后祁艾有效成分含量最高,最终确定祁艾的最佳采收期。此外,付士朋等[20]测定不同采收期芍药中有效成分含量,并探究其含量与采收期之间的变化规律。月季花的研究多局限在黄酮含量测定及提取工艺方面,但关于月季花在不同的采收期其有效成分是否有较大的差异尚未见报道。

本实验以2019年4月中旬至11月中旬采收的月季花为研究对象,测定不同采收期月季花总黄酮含量,并以其清除DPPH·、羟基自由基的能力来评价其抗氧化活性,探究其总黄酮含量与抗氧化活性的相关性,最终确定月季花最佳采收期,为其资源的开发、临床应用、质量标准的建立提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

月季花 采集于河南省新乡医学院三全学院校园内,经闫福林教授鉴定为蔷薇科蔷薇属植物月季;芦丁对照品 纯度98%,中国食品药品检定研究院;1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH) 东京化成工业株式会社;L-抗坏血酸(VC) 上海源叶生物科技有限公司;无水乙醇、氢氧化钠、硝酸铝、亚硝酸钠、石油醚、乙酸乙酯 分析纯,天津市德恩化学试剂有限公司。

ME203E/02型电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;R206型旋转蒸发仪 上海申生科技有限公司;101-3ES型电热鼓风干燥箱 北京市永光明医疗仪器有限公司;SHB-III型循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司;CAA-420型低温冷却水循环泵 郑州杜甫仪器厂;T6型新世纪紫外可见分光光度仪 北京普析通用仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 月季花预处理 将2019年4月中旬-11月中旬(表1)的月季花清洗干净,晾晒至干燥,粉碎,过60目筛,分别置于密封袋中保存,备用。

表1 月季花样品信息

1.2.2 芦丁标准曲线的绘制 精密吸取质量浓度为0.1 mg/mL芦丁母液 0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL,分别置于10 mL容量瓶中,采用NaNO2-Al(NO3)3法显色,分别加入5% NaNO20.4 mL,摇匀,6 min后加入10% Al(NO3)30.4 mL,摇匀,6 min后再加入4% NaOH 溶液4 mL,蒸馏水定容至刻度,15 min后于波长510 nm处测定不同浓度芦丁的吸光度A[21]。以芦丁浓度C(μg/mL)为横坐标,吸光度A为纵坐标,在0.1～0.5 mg/mL范围内得线性回归方程y=1.8109x-0.0561,决定系数R2=0.9998。

1.2.3 供试品溶液的制备 参照钱慧琴等[22]的提取方法制备供试液,精密称取不同采收期月季花粉末2 g,按液料比42∶1 mL/g加入60%乙醇溶液,于87 ℃下加热回流提取85 min,过滤,滤液于55 ℃减压浓缩至无醇味,依次用石油醚、乙酸乙酯萃取,取乙酸乙酯部位减压浓缩至浸膏,加无水乙醇溶解并转移至100 mL容量瓶中,定容至刻度,即得月季花供试品溶液。

1.2.4 月季花总黄酮含量的测定 精密吸取不同采收时期月季花供试品溶液1.00 mL,置10 mL容量瓶中,采用NaNO2-Al(NO3)3法显色,于510 nm处测定月季花供试品溶液的吸光度。不同采收期月季花总黄酮的含量的按式(1)计算。其中,供试品溶液的浓度按照芦丁标准曲线的回归方程计算。

式(1)

式中:Y为月季花总黄酮含量,mg/g;C为月季花总黄酮的质量浓度,mg/mL;V为测量总黄酮提取液体积，mL;N为稀释倍数;M为月季花干品质量,g。

1.2.5 月季花不同采收期抗氧化活性评价

1.2.5.1 清除DPPH自由基能力测定 参照闫蕊等[23]的方法并加以修改,将不同采收期月季花供试品溶液配成 2、8、14、20、26、32、40、50 μg/mL不同质量浓度的样品溶液,吸取2 mL不同质量浓度的样品溶液置于试管中,加入质量浓度为2.55×10-4mol/L的DPPH乙醇溶液(临用现配)2 mL,摇匀,避光反应30 min后于517 nm波长处测其吸光度A1。同时测定2 mL样品溶液和2 mL无水乙醇的吸光度A2,2 mL无水乙醇和2 mL DPPH乙醇溶液的吸光度A0。以相同质量浓度的VC溶液作为对照组。根据式(2)计算DPPH·清除率,即:

式(2)

式中,W表示DPPH·清除率,A1表示加入样品的吸光度,A2表示样品参比溶液的吸光度,A0表示未加样品的吸光度。

表2 不同采收期月季花提取物中的总黄酮含量(n=3)

1.2.5.2 清除羟基自由基(OH·)能力测定 参照张春生等[24]的方法并加以修改,配制不同质量浓度0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、1.2、1.5 mg/mL的月季花样品溶液,依次加入9 mmol/L FeSO4溶液、9 mmol/L的水杨酸-乙醇溶液、不同质量浓度的样品溶液各1 mL,再加入4 mL 20 mmol/L H2O2溶液,摇匀,37 ℃水浴下反应30 min,于510 nm处测定吸光度A1;同时测定等体积的去离子水代替H2O2溶液的吸光度A2;测定等体积的乙醇溶液代替样品溶液的吸光度A0。以相同质量浓度的 VC溶液作为对照组。根据式(3)计算OH·清除率,即:

式(3)

式中,W表示OH·清除率,A1表示加入样品的吸光度,A2表示样品参比溶液的吸光度,A0表示未加样品的吸光度。

1.3 数据处理

上述实验均重复三次,运用数据分析软件SPSS 20.0及Excel进行图表的绘制及数据的处理,实验数据均以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 不同采收期月季花中黄酮含量的动态变化规律

由表2所示,不同采收期的月季花中总黄酮含量是呈动态变化的,4月中旬至9月中旬,随着采收期的延长,月季花中总黄酮的含量呈现下降而又骤然上升的趋势;9月中旬至11月中旬,月季花总黄酮含量缓慢下降趋于平缓。其中,4月中旬月季花总黄酮含量最高,为(152.28±1.69) mg/g,5月中旬月季花总黄酮含量次之,为(147.11±1.05) mg/g。8月中旬时月季花总黄酮含量最低,为(106.54±2.00) mg/g。一般认为黄酮的积累与植物的生长期、温度和水分有关[19]。4月总黄酮最高可能因为月季花尚未完全开放,且生长温度较低,越冬芽发育的早期幼苗生长较慢,黄酮积累较丰富有关。8月月季花总黄酮最低可能是由于该时期花已经完全开放,且天气炎热,降雨量多,作物生长较快,黄酮积累较少有关。

2.2 不同采收期月季花的抗氧化活性评价

2.2.1 清除DPPH·能力 由图1可知,在质量浓度2～50 μg/mL范围内,随着不同采收期的月季花总黄酮溶液和阳性对照VC质量浓度的增大,对DPPH·清除率逐渐增强而趋于平衡。通过SPSS 20.0软件计算不同采收期月季花总黄酮溶液和VC对DPPH·的半数清除率IC50,如图2所示。7月、8月采收的月季花所含总黄酮对DPPH·的半数清除率(IC50=1.792,2.772 μg/mL)明显低于VC(IC50=4.806 μg/mL),说明7月、8月采收的月季花所含总黄酮对DPPH·的清除能力高于VC,其中7月份月季花总黄酮对DPPH·清除能力最强。4～6月、9～11月采集月季花的总黄酮对DPPH·的半数清除率IC50均高于VC,说明此时抗氧化活性均弱于VC。由此可见,不同采收期的月季花总黄酮含量呈现出不同程度的清除DPPH·的能力,表现出不同程度的抗氧化活性,这可能是因为月季花在不同采收期黄酮类成分积累虽存在较大差异,但是黄酮类成分的结构不同,所起到的抗氧化活性不相同[25-26],对月季花的抗氧化活性也有一定程度的影响。

图1 不同采收期月季花总黄酮对DPPH· 的清除能力

图2 不同采收期月季花总黄酮对DPPH·的半数清除率IC50

2.2.2 清除羟基自由基能力 由图3所示,不同采收期月季花总黄酮对OH·的清除能力随着样品和VC质量浓度的增加而不断的增强,体现出显著的量效关系。不同采收期月季花总黄酮溶液和VC对OH·的半数清除率IC50如图4所示,不同采收期的月季花总黄酮对OH·的半数清除率均高于VC,说明不同采收期的月季花总黄酮对OH·清除能力均弱于VC,但依然表现出一定的抗氧化活性。在月季花不同采收期中,7月份月季花总黄酮清除OH·的能力最强,这与上述清除DPPH·的结果是一致的。

2.3 抗氧化活性与总黄酮含量相关性分析

由表3可知,不同采收期月季花总黄酮含量与DPPH自由基清除能力的相关系数范围为0.8000～0.9842,除了11月份呈显著相关(P<0.05)外,其他月份均呈现极显著相关(P<0.01);不同采收期月季花总黄酮与OH自由基清除能力的相关系数范围为0.9639～0.9947,均呈现极显著相关(P<0.01),因此可以推断月季花总黄酮含量与其抗氧化活性均呈一定的相关性,总黄酮含量越高,抗氧化活性越高,黄酮的含量是影响月季花抗氧化活性的重要因素。

表3 不同采收期的月季花提取物中总黄酮含量与抗氧化活性的相关性分析

图3 不同采收期月季花总黄酮对OH·的清除能力

图4 不同采收期月季花总黄酮对OH·的半数清除率IC50

3 讨论与结论

本研究以不同采收期月季花为研究对象,比较其总黄酮含量和抗氧化活性。结果表明,月季花总黄酮含量不同的采收期内其含量差异很大,其含量变化为:4月份>5月份>9月份>10月份>11月份>6月份>7月份>8月份。4月份采收的月季花总黄酮含量最高,8月份采收的月季花总黄酮含量最低。月季花总黄酮含量表现出明显的季节规律性,在春季和秋季含量比较高,尤其是在春季,含量最高。月季花总黄酮含量的波动主要与其生长周期,生长环境,采收次数,初采时间,采收间隔时间等[27]因素有关。这一结果与薛紫鲸等[19]不同采收期祁艾化学成分差异性研究结果相一致。

体外抗氧化活性研究结果显示7月份采收的月季花总黄酮清除DPPH自由基和OH自由基的能力最强。相关性分析结果表明,月季花总黄酮含量与其抗氧化活性均具显著相关性,但是体外抗氧化活性试验显示月季花的抗氧化活性与总黄酮含量不是正相关的。这可能是由于在不同采收期中月季花积累的黄酮的结构不同,发挥的抗氧化活性有一定差异,另外在提取过程中,若温度过高会造成黄酮结构的破坏,促进其他杂质的溶出,从而影响其抗氧化活性。

综合考虑,4月份月季花总黄酮含量最高,若此时采摘将影响月季的生长,且抗氧化试验表明4月的抗氧化活性并不是最高的。7月份采摘月季花其抗氧化活性最高,药用价值较高,故以7月份采摘月季花的最佳时期。另外相关性分析显示,月季花总黄酮是其抗氧化的主要活性成分,但其具体的黄酮物质的组成和含量以及其他杂质对于抗氧化活性关系仍需进一步分析和完善。