高原地区宫颈癌患者血清mir-210表达与HPV感染及Th17/Treg平衡的关系

白志兴

宫颈癌属于常见妇科恶性肿瘤之一，发病率、死亡率较高，严重威胁女性健康[1]。人类乳头瘤病毒(human papillomaviruses,HPV)长期潜伏在生殖道，当机体免疫下降后引发肿瘤，一部分患者持续感染则会引发宫颈癌，已有研究证实HPV感染是造成宫颈癌的明确致病因素之一[2]。除宫颈癌感染外，还有其他遗传相关因子参与宫颈癌的发生、发展。microRNA属于非编码RNA，与肿瘤的转移、侵袭等发生发展过程密切相关，mir-210作为microRNA之一，在多种实体瘤呈高表达，然而目前mir-210与宫颈癌HPV感染的关系尚不明确[3,4]。有研究发现宫颈癌患者HPV免疫逃逸与宫颈癌的发生密切相关，免疫细胞Th17/Treg细胞失衡在其中具有重要的作用[5]。本研究通过检测宫颈癌患者血清mir-210表达，分析其与HPV感染、免疫功能的关系，为进一步揭示宫颈癌发病机制提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2018年2月至2019年4月在我院进行治疗的85例青海高原地区宫颈癌患者作为研究对象(宫颈癌组)，年龄37～75岁，平均年龄(55.31±12.25)岁；根据国际产妇科联盟(FIGO)肿瘤分期标准，其中ⅠA～ⅡA期39例，ⅡB～Ⅳ期46例。鳞癌患者62例，腺癌患者23例。另选择在我院由于其他良性肿瘤进行子宫切除术的76例正常者作为对照组，年龄36～72岁，平均年龄(54.26±11.87)岁。2组年龄比较，差异无统计学意义(P<0.05)。

1.2 纳入与排除标准 纳入标准：(1)患者均经病理学证实；(2)术前未接受过化疗、放疗或其他治疗；(3)所有受试者者知情同意；(4)临床资料完整。排除标准：(1)合并其它部位恶性肿瘤；(2)自身免疫疾病者；(3)心、肝、肾等重要器官障碍；(4)合并慢性高血压、糖尿病等；(5)妊娠、哺乳期。

1.3 主要试剂与仪器 RNA提取试剂盒(R1200)购自美国Solarbio 公司；逆转录试剂盒(K1622)购自美国Thermo公司；qPCR反应试剂盒(RR390B)购于日本Taraka公司；白介素-17(Interleukins-17，IL-17)(ab73202)、白介素-10(Interleukins-10，IL-10)(ab33471)抗体购于英国Abcam公司；IL-17(JKSJ-1316)、IL-10检测试剂盒[JK-(a)-2145]购自上海晶抗生物工程有限公司；HPV核酸扩增试剂盒购于广东凯普生物科技股份有限公司，批号：20180418；基因自DNA提取试剂盒(K281-50)购于美国BioVision公司；流式细胞仪(ALTRA)购自美国Beckman公司；酶标检测仪(Bench Mark Plus)购自美国Bio-Rad公司；PCR仪器(7500型)购自美国ABI公司。

1.4 荧光定量PCR(qRT-PCR)反应检测所有受试者miR-210表达 所有受试者入院后用抗凝管采集外周静脉血5 ml，3 000 g离心后收集上层血清置于-80℃保存。血液中总RNA提取参考RNA提取试剂盒说明书操作，核酸测定仪检测RNA纯度及浓度后，将RNA参照试剂盒逆转录为cDNA。配制PCR反应体系：SYBR Premix ExTaqII(2×)12.5 μl，上下游引物分别为1 μl，模板 2 μl，dH2O 8.5 μl，总量 25 μl。 PCR 程序设置：95℃预变性30 s；95℃变性 10 s,58℃退火30 s，40个循环。以U6作为内参，利用2-ΔΔCt法定量分析miR-210相对表达量。

1.6 酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，Elisa)检测血清中IL-17A、IL-10水平 设定待测样品孔、标准品孔、空白对照孔，每孔设定3个重复，空白孔内仅添加TMB显色液及终止液。每个包被孔中均加入100 μl标准品或待测样品，充分混匀后，37℃孵育2 h，充分洗涤、印干后加入100 μl生物素化的抗人IL-17A、IL-10 抗体工作液，充分混匀后置 37℃ 1 h，清洗、晾干后添加100 μl辣根过氧化物酶标记的 Streptavidin抗体工作液 。室温下孵育0.5 h清洗后加入100 μl TMB工作液， 37℃暗避光条件下进行15 min 显色反应，加入100 μl终止液混匀，30 min内用酶标仪检测450 nm波长处吸光值，制作标准品曲线，根据所测吸光值，计算初始样品中IL-17A、IL-10水平。

1.7 宫颈HPV筛查 在宫颈癌患者宫颈部位放置宫颈刷，旋转5～10圈后收集宫颈口附近脱落细胞，在保存液中保存，将收集到的细胞经2 000 g离心后5 min舍弃上清，提取DNA，根据试剂盒进行HPV检测，当结果为清晰可见的蓝紫色原点则代表阳性结果。

2 结果

2.1 正常、宫颈癌患者血清mir-210表达、Th17和Treg比率比较 与正常组比较，宫颈癌组患者血清mir-210表达、Th17细胞比例、Treg细胞比例均升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 2组血清mir-210、Th17细胞比例、Treg细胞比例比较

2.2 宫颈癌HPV感染者血清mir-210表达 与HPV阴性组比较，HPV阳性组患者血清mir-210表达升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.3 宫颈癌HPV感染者Th17/Treg细胞、IL-17、IL-10水平 与HPV阴性组比较，HPV阳性组患者血清Th17细胞比例、Treg细胞比例、IL-17、IL-10因子水平均升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表2 宫颈癌HPV感染、未感染组患者血清mir-210表达比较

表3 宫颈癌HPV感染、未感染组患者血清Th17/Treg细胞、IL-17、IL-10水平比较

2.4 mir-210在宫颈癌HPV感染中的诊断价值 ROC分析显示，mir-210对宫颈癌HPV预测的ROC曲线AUC值为0.763(95%CI：0.658～0.848)，临界值为1.808，灵敏度为78.05%，特异度为72.73%，约登指数为0.507。见图1。

图1 ROC分析mir-210对宫颈癌HPV感染的诊断价值

2.5 相关性分析mir-210表达与Th17/Treg细胞、IL-17A、IL-10的相关性 宫颈癌患者mir-210表达与Th17细胞比例、Treg细胞细胞比例呈显著性正相关(r=0.387，r=0.596，P均<0.05)。mir-210表达与IL-17A、IL-10呈显著性正相关(r=0.425，r=0.403，P均<0.05)。见图2。

3 讨论

miRNA经靶向结合靶基因mRNA的3’非翻译区(3’UTR)来抑制靶基因转录后表达。研究证实miRNA与细胞凋亡、分化等发生相关[6]。此外miRNA异常表达、突变与癌症的发生相关，通过调节下游靶点，并进一步影响致瘤性发生。因此，miRNA在肿瘤组织中的表达可作为诊断和预后评估的新靶点。多种miRNA与宫颈癌发病机制密切有关。Wang等[7]研究发现mir-328通过靶向TCF7l2抑制宫颈癌细胞增殖和肿瘤发生。Shishodia等[8]发现miR-21 与 let-7a结合后通过调控STAT3信号通路参与宫颈癌的发生。HPV病毒为宫颈感染病毒之一，多项研究显示HPV病毒感染与多种肿瘤如头颈部、肺癌、宫颈癌的发生密切相关[9,10]。HPV病毒感染后可通过特定基因如E6、E7等基因调控细胞凋亡，进而调控肿瘤的增殖等。近期有研究发现miRNA的异常表达与宫颈癌HPV感染的发生有关，Liu等[11]研究发现hpv16e5基因通过下调mir196a在宫颈感染时的表达，启动正常宫颈细胞向宫颈癌的转化。Gómez-Gómez等[12]研究发现E7癌蛋白和17β-雌二醇(e2)通过上调mir-21和mir-143，进而参与宫颈癌HPV发生。这些研究提示miRNA与宫颈癌及HPV感染密切相关。

图2 Pearson相关性分析宫颈癌患者mir-210表达与Th17/Treg细胞、IL-17A、IL-10的关系

miR-210主要存在缺氧细胞及组织中，与炎症、组织缺血、肿瘤等发生有关。体外研究发现过表达miR-210能够抑制TLR4信号通路，进而抑制TNF-α、IL-6有关炎性因子表达[13]。基础研究发现，低氧环境诱导后miR-210表达显著降低，且其能够通过诱导细胞凋亡途径，加速细胞凋亡[14]。在肺癌中发现肺癌组织中miR-210通过调控缺氧诱导因子进而参与肿瘤的发生[15]。然而miR-210与宫颈癌HPV的关系，目前研究较少。本研究结果发现宫颈癌患者血清中mir-210表达显著高于正常者，进一步对HPV感染宫颈癌患者分析发现宫颈癌HPV阳性感染者血清中mir-210显著高于HPV阴性者，这些结果提示mir-210参与宫颈癌的发生、发展。鉴于miR-210在宫颈癌HPV感染、未感染者之间的差异，推测mir-210可能对宫颈癌HPV感染具有一定的鉴别价值，采用ROC分析发现mir-210对宫颈癌HPV预测的AUC值为0.763，灵敏度为78.05%，特异度为72.73%，提示miR-210对宫颈癌HPV感染具有一定的诊断价值。

Treg细胞、Th17细胞均为T淋巴细胞亚群，Th17细胞在炎性反应中发挥重要的调控作用，IL-17为Th17细胞分泌的主要炎性因子，过往研究发现IL-17在自身免疫疾病及感染疾病的发生、进展中发挥重要的调控作用[16]。Treg细胞具有免疫抑制作用，可抑制T细胞免疫反应，参与乳腺癌、宫颈癌等癌症的发生、发展，IL-10为Treg细胞分泌的主要炎性因子。Treg细胞、Th17细胞处于动态平衡，一旦两细胞比例失调则会引发肿瘤。本研究发现宫颈癌患者血清TH17细胞比例、Treg细胞比例均明显高于正常组，且HPV阳性者三项指标明显高于HPV阴性者，提示Th17/Treg细胞失衡可能与宫颈癌病变有关，参与宫颈癌的发生发展。进一步对两种细胞分泌炎性因子分析发现与HPV阴性组比较，HPV阳性组患者血清IL-17、IL-10因子水平均升高，推测HPV感染后可能通过影响Th17/Treg细胞平衡进而引发免疫失衡，促进宫颈癌的发生。

综上所述，mir-210在宫颈癌中上调表达，与HPV感染及Th17/Treg细胞失衡有关，在HPV感染中具有一定的鉴别价值。然而本研究也存在不足之处，纳入病例样本数量不多，未深入分析miR-210与Th17/Treg细胞失衡间的作用机制，这还有待后续深入研究，以提供更充分的依据。