FMO3调节NEFA介导的犊牛原代肝细胞内质网应激

邓清华，宋景旭，刘婷，张焱，谢志凤，刘国文,2*

（1.内蒙古民族大学动物科学技术学院，内蒙古通辽028000；2.吉林大学动物医学学院，长春130062；3.吉林省松原市前郭县医院，吉林松原138000）

内质网（Endoplasmic reticulum，ER）是真核细胞中一种特殊的结构，其形状和结构决定了该细胞器内发生的生物功能。内质网由一个复杂的膜系统组成，分泌蛋白和膜蛋白的合成、折叠和翻译后修饰，内质网的结构是动态的，通过快速变化以满足细胞对生理或病理刺激的需求[1]。不同来源和不同功能的细胞也表现出不同的内质网结构[2]。然而，当细胞受到低氧、营养缺失、钙离子紊乱、氧化应激以及病毒感染等刺激时，内质网的功能被破坏，导致错误蛋白或未折叠的蛋白质大量蓄积在内质网腔内，当内质网难以承受高负荷的蛋白折叠时则引发内质网应激（Endoplasmic reticulum stress，ERS）[3]。有研究表明，内质网应激可以引起脂代谢紊乱，增加脂合成，引发脂肪肝[4]。人类非酒精性脂肪肝病（Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是与肥胖密切相关的疾病。有很多研究指出内质网应激与NAFLD的发病有关[5-7]。围产期奶牛脂质代谢紊乱，常常发生肝脂沉积、酮病、胰岛素抵抗等营养代谢性疾病，这些代谢病都与内质网应激密不可分。

含黄素单加氧酶（Flavin Containing Monooxy⁃genase，FMO）3是FMOs的一种亚型，主要在肝脏中表达，其广泛分布于内质网中[8]。FMO3是近五年发现的与脂代谢、内质网应激等相关的调节因子[9]。由于奶牛特殊的代谢特征，它的代谢过程可能与人和鼠的不同，所以本实验以奶牛肝细胞为研究对象，通过添加NEFA诱导内质网应激，研究FMO3在调节内质网应激中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 试验动物

1日龄健康荷斯坦犊牛。

1.2 主要试剂

天根2×Taq PCR Mastermix；碧云天细胞裂解液（PMSF）；Takara DL2000 DNA Marker和逆转录试剂盒；Roche荧光定量试剂；FMO3和β-actin一抗均购于CST，羊抗兔二抗购于BOSTER；NEFA（配制方法：油酸4.35 mmol·L-1，亚油酸0.49 mmol·L-1，棕榈酸3.19 mmol·L-1，硬脂酸1.44 mmol·L-1，棕榈油酸0.53 mmol·L-1。113 mL 0.1 mol·L-1 KOH加热至60℃，以上5种酸充分溶解后加入7.5 mL预热至60℃的1 mol·L-1的HCl，充分混匀后加入67.8 mL预热至60℃的五馏水，即配制成53.4 mmol·L-1的贮存液，放于-20℃冷藏备用）。

1.3 试验方法

1.3.1肝细胞的分离与培养

1日龄的禁食犊牛以无菌方法取出肝脏尾状突。用两步灌流法分离犊牛原代肝细胞[10]。分离后用贴壁培养基稀释至5×105个细胞·mL-1，每孔2 mL接种至6孔细胞培养板，在37℃，5%CO2下进行培养4 h后换基础培养基。继续培养72 h后进行后续操作。

1.3.2腺病毒载体的构建及感染肝细胞

根据GenBank中牛FMO3基因的编码序列，构建FMO3基因的低表达和过表达腺病毒载体，培养HEK293细胞进行病毒的包装、扩增和纯化，所得重组腺病毒测定其滴度，并达到109 PFU·mL-1开始收集病毒。将体外分离的肝细胞贴壁培养72 h后用低表达、过表达和空腺病毒载体感染，每组6个重复孔，病毒感染复数（MOI）设为100[11]，继续培养48 h后收集细胞保存于-80℃。

1.3.3 NEFA刺激犊牛原代肝细胞

添加NEFA（2.4 mmol·L-1），每组6个重复孔，刺激9 h后感染腺病毒。

1.3.4细胞分组

细胞总共分为7组，设空白对照组（Control）、低表达FMO3腺病毒载体组（LOW）、过表达FMO3组（OVER）、阴性对照组（NC，腺病毒空载体）、NEFA组（添加2.4 mmol·L-1 NEFA）、低表达FMO3腺病毒载体与NEFA混合添加组（NEFA+LOW）、过表达FMO3腺病毒载体与NEFA混合添加组（NE⁃FA+OVER）。

1.3.5实时荧光定量PCR

细胞感染48 h后用Trizol收集细胞，提取RNA，反转录成cDNA。根据Genbank中牛的FMO3、XBP-1s、ATF4、ATF6、P58IPK和β-actin基因序列，用primer5软件设计引物，引物序列见表1。以β-actin为参照，用Step One Plus荧光定量PCR检测FMO3、XBP-1s、ATF4、ATF6和P58IPK的mRNA相对表达量。

表1 qRT-PCR相关引物

1.3.6 western-blot

细胞感染48 h后收取各组细胞，用PBS清洗2次，弃掉液体。加入250μL裂解液，冰上裂解15 min，14 000 r·min-1离心15 min，取上清。用碧云天BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，取40μg进行蛋白免疫印迹试验。

2 结果与分析

2.1 犊牛原代肝细胞感染重组腺病毒

如图1所示，犊牛原代肝细胞感染FMO3低表达（见图1A）和过表达（见图1B）腺病毒载体后，绿色荧光蛋白的表达量可以达到70%左右。说明重组腺病毒可以稳定地在犊牛原代肝细胞中表达。

2.2 FMO3低表达和过表达腺病毒载体对犊牛原代肝细胞FMO3 mRNA和蛋白水平的影响

如图2所示，与空白对照组相比，FMO3低表达腺病毒明显降低了FMO3的mRNA和蛋白表达水平（P<0.01），而FMO3过表达腺病毒明显增加了FMO3的mRNA和蛋白表达水平（P<0.01），阴性对照组（NC）与空白对照组相比没有显著差异（P>0.05）（见图2）。

2.3 FMO3和NEFA对犊牛原代肝细胞XBP-1s、ATF4、ATF6和P58IPK mRNA水平的影响

如图3所示，与空白对照组相比，NEFA能明显增加奶牛肝细胞中XBP-1s的mRNA表达水平（P<0.01）；NC组与空白对照组相比无显著差异（P>0.05）；NEFA+OVER组明显高于空白对照组和NEFA组（P<0.01）；NEFA+LOW组明显低于空白对照组和NEFA组（P<0.01）（见图3A）。

图1细胞感染FMO3腺病毒后荧光共聚焦结果（100×）

与空白对照组相比，NEFA能明显增加奶牛肝细胞中ATF4的mRNA表达水平（P<0.01）；NC组与空白对照组相比无显著差异（P>0.05）；NEFA+OVER组明显高于空白对照组和NEFA组（P<0.01）；NEFA+LOW组明显低于NEFA组（P<0.01）但是与空白对照组相比差异不显著（P>0.05）（见图3B）。

与空白对照组相比，NEFA能明显增加奶牛肝细胞中ATF6的mRNA表达水平（P<0.01）；NC组与空白对照组相比无显著差异（P>0.05）；NEFA+OVER组明显高于空白对照组和NEFA组（P<0.01）；NEFA+LOW组明显低于NEFA组（P<0.01）但是与空白对照组相比差异不显著（P>0.05）（见图3C）。

图2 FMO3低表达和过表达对FMO3 mRNA和蛋白表达量的影响

图3犊牛原代肝细胞感染低表达、过表达和空载体48 h后用qRT-PCR检测XBP-1s，ATF4，ATF6和P58IPK的mRNA表达量

与空白对照组相比，NEFA能明显增加奶牛肝细胞中P58IPK的mRNA表达水平（P<0.01）；NC组与空白对照组相比无显著差异（P>0.05）；NEFA+OVER组明显高于空白对照组和NEFA组（P<0.01）；NEFA+LOW组明显低于NEFA组（P<0.01）但是与空白对照组相比差异不显著（P>0.05）（见图3D）。

3 讨论

ER广泛存在于真核细胞中，是细胞中最大的细胞器。ER在细胞中具有重要的作用，不仅是蛋白质合成、折叠、加工及其质量监控的重要场所，还是钙离子储存的主要场所，同时内质网还是脂质代谢发生的主要场所[12]。为维持内质网平衡，在肌醇需求酶1（Inositol-requiring Enzyme 1，IRE1）、蛋白激酶R样内质网激酶（Protein kinase R-like Endoplasmic Reticulum Kinase，PERK）和激活转录因子6（Activating Transcription Factor 6，ATF6）三种相对内质网蛋白的作用下，触发了未折叠蛋白反应（Unfolded Protein Response，UPR），激活了三种途径[13]。作为对内质网应激的响应，PERK的激活通过真核细胞翻译起始因子2α（Eukaryotic translation initiation factor 2α，eIF2α）的磷酸化来调节细胞蛋白质的合成，转录因子ATF4优先被翻译[14]。IRE-1通过从X盒结合蛋白（X box-binding protein，XBP-1）mRNA剪接26个核苷酸触发下游信号的变化，剪接的XBP1 mRNA编码一种功能性转录因子，介导折叠机械和脂质合成基因的诱导，这两种基因都是正确的内质网应激反应所必需的[15]。ERS状态下，ATF6被切割并进入细胞核，促进ERS基因的转录。这些信号级联的激活导致各种UPR靶基因的上调，以恢复内质网稳态[16]。在小鼠中，PERK、IRE1和ATF6的基因敲除揭示了这三个传感器不仅对病理性内质网应激而且对生理性内质网应激的特异性作用[17]。分子伴侣蛋白P58IPK是PERK的负调节因子，定位在ER管腔中[18]。缺少P58IPK的小鼠比野生型产仔弱，并且由于胰腺b细胞功能受损而患上糖尿病[19]。对缺乏P58IPK或ATF6的动物研究表明，P58IPK的主要功能是保护ER的蛋白质折叠能力，并增加了P58IPK可能在内分泌胰腺以外的组织中发挥这一作用的可能性[20]。

FMO3主要分布于肝脏组织的内质网中，本研究发现，FMO3过度表达腺病毒与NEFA混合添加能增加奶牛肝细胞中XBP-1、ATF4、ATF6和p58IPK的mRNA表达量，然而FMO3低表达腺病毒与NEFA混合添加却能降低奶牛肝细胞中XBP-1、ATF4、ATF6和p58IPK的mRNA表达量。NEFA明显增加了XBP-1、ATF4、ATF6和p58IPK的mRNA表达量。这些结果说明，NEFA可以诱导奶牛肝细胞的内质网应激反应，并且FMO3过表达腺病毒能增加NEFA诱导的内质网应激，而FMO3低表达能降低NEFA介导的内质网应激。而内质网应激与脂代谢的关系密不可分，可通过调节ERS来调节肝脏脂代谢反应，降低FMO3的表达量降低奶牛围产期的内质网应激反应，从而降低脂代谢。以上研究结果可为奶牛内质网应激反应的发生机理提供一定的理论基础，并为奶牛围产期营养代谢病的防治提供坚实的理论依据。