胚胎植入前遗传学诊断技术的现状和未来挑战

刘双，程东凯，于洪君，李宝山

（沈阳东方菁华医院，辽宁 沈阳）

0 引言

胚胎植入前遗传学诊断（PGD）于1990年首次应用，通过选择女性胚胎来预防x连锁隐性遗传病男性患者的出生[1]。从那时起，诊断、活检的适应症和活检方法一直是伦理学家讨论的主题。PGD最初的目的是防止严重遗传性疾病从携带者遗传给后代。随着科学技术的发展，PGD的应用正在扩大，包括植入前基因筛查（PGS）和“设计婴儿”。PGS主要用于诊断染色体非整倍性的发生[2,3]。“设计婴儿”的概念是为那些寻找具有相容性供体进行脐带血移植的人而提出的[4]。

遗传诊断已经发展到可以进行全面遗传分析的程度。PGD传统的检测方式为荧光原位杂交（FISH）。随着检测技术的进步，单细胞DNA全基因组扩增（whole genome amplification, WGA）的发展为PGD的应用带来了巨大的优势。WGA使用微阵列技术能够用于PGD和PGS的检测[5]。虽然PGD对遗传病携带者的益处已被广泛接受，但在适应症、诊断方法、活检分期和治疗效率方面，PGS的使用仍是一个有争议的话题。

1 胚胎活检

胚胎植入前遗传诊断包括辅助生殖技术和遗传诊断。传统的胚胎活检方法为在第三天卵裂期8细胞阶段取1-2个细胞进行活检。虽然2个细胞活检的诊断准确性优于单细胞活检，但收集两个细胞对胚胎发育和植入的危害可能会增加[6]。另一方面，一项研究表明，在一个和两个细胞活检标本的准确性上没有显著差异[7]。

囊胚期活检是目前大家常用的一种方法。该方法在第5天活检5-10个滋养外胚层细胞。胚泡活检的好处包括能够收集更多的细胞，提高扩增效率，减少误诊和成本。单个细胞进行扩增总是存在扩增失败、污染和等位基因脱落（ADO）的风险，许多研究试图提高这些技术的诊断效果[8-10]。然而更准确的结果往往需要更大的样本量。此外，据报道，囊胚中的非整倍性率显着低于卵裂期胚胎[11]。一般情况下在胚胎第三天对胚胎进行辅助孵化（AH）技术，并在第五天囊胚期收集孵出的滋养层细胞。但是，有时候内细胞团会从透明带打开的位置溢出。为了避免活检时伤到内细胞团，另一种方法是第5天在远离内细胞团的透明带处给与AH，并收集溢出的滋养外胚层。

极体活检也是进行PGD胚胎活检的一种方法。极体本身对胚胎发育没有贡献，这就是为什么极体活检被认为侵入性比胚胎细胞活检更少的原因。然而，第一极体和第二极体有时很难区分，在技术上也很难收集。极性体活检的主要局限性是只能获得母亲的遗传信息；因此，极性体分析的主要目的是确定染色体的非整倍性。

2 单基因遗传病的PGD诊断

单基因遗传性疾病的遗传模式包括常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传、x连锁显性遗传、x连锁隐性遗传和线粒体遗传。可行的PGD的先决条件是清楚的了解这对夫妇携带的某些遗传性疾病的突变等位基因，以寻求IVF+PGD。遗传分析主要是基于PCR技术应用于从早期胚胎分裂阶段获得的单细胞样本。然而，PGD的准确性和诊断效率一直受到限制，因为单细胞诊断在技术上是最具挑战性和难度的，极有可能产生质量不理想的结果。扩增失败、ADO、嵌合现象以及污染都会影响单细胞PCR扩增的效果。当细胞中两个等位基因中只有一个被扩增到可检测水平时，就会发生ADO，这通常影响5-20%的单细胞扩增。

由于单细胞诊断总是有绝对的局限性，双细胞活检可以在不降低植入效率的情况下提供更高的诊断准确性。囊胚活检可对5个细胞进行取样，便于诊断，降低误诊风险。为了提高诊断准确性和扩大诊断变异，需要对DNA扩增方法进行优化。WGA被认为有很大潜力为每一个独立的PCR扩增提供足够的DNA模板，包括检测突变和多态性标记。当一种疾病突变已知时，主要是在胚胎活检的细胞中进行分析。然而，当致病突变未知时，则通过连锁分析（或性别关联疾病的性别分析）进行诊断。该方法目前正在研究中，以确保单核苷酸多态性（SNP）可用于单个突变的表型和多态分析[12]。

未受影响的可移植胚胎的数量也因遗传疾病类型的不同而不同。据估计，常染色体隐性疾病中受累胚胎的频率为1/4，常染色体显性疾病中为1/2，x连锁隐性疾病中为1/4。

3 WGA技术

WGA技术有很多优点，特别是在PGD的应用中。PGD最大的技术难题是分析来自一个或几个细胞的有限数量的DNA拷贝。WGA为包括突变检测和单体型分析在内的独立PCR扩增提供了足够的DNA模板。WGA的另一个优点是能够通过重复分析和单体型分型来确认诊断。此外，WGA被认为可以降低扩增失败或ADO造成误诊的风险。

WGA过程的原理分为两类：①基于pcr原理；②非基于pcr原理。在WGA开发的初始阶段，利用15个碱基寡核苷酸随机引物进行引物扩增（PEP），开发了一种基于pcr的WGA。第二阶段是简并寡核苷酸引物PCR （dopp -PCR），它使用部分简并序列的引物来提高扩增效率。基于PCR原理WGA的两种技术GenomePlex和PicoPlex目前已用于PGD或PGS。它涉及到使用一种来自嗜热细菌的DNA聚合酶，并在适宜的温度之间重复循环，从而使DNA依次变性和伸长。GenomPlex是PEP和DOPPCR的组合扩增技术，使用简并寡核苷酸引物与通用接头匹配的引物连接，用于片段化模板。PicoPlex是继GenomPlex之后发展起来的，与BAC克隆微阵列分析相匹配，目前广泛应用于aCGH分析。

基于非PCR的WGA基于多重置换扩增（MDA）和外切核酸酶抗性引物和噬菌体u29 DNA聚合酶。MDA在恒温反应中进行，产生具有多种结构的扩增的DNA产物（长度为10kb）。MDA产物可通过PCR和寡核苷酸序列进行单体型分析。

4 芯片诊断技术

WGA技术与临床微阵列技术相结合，实现了PGD基因的综合分析。在比较基因组杂交（CGH）中，通过WGA扩增检测和对照DNA，用荧光色素（Cy3和Cy5）进行差异标记。将标记的DNA混合并应用于竞争杂交的微阵列。在这项技术发展的历史上，已经提出了包含小DNA （aCGH）的阵列平台，并成功地从单个细胞中进行了分析。迄今为止，利用BAC克隆的aCGH检测染色体不平衡和非整倍体的高检测性能已被广泛应用[13]。aCGH技术的不足包括无法检测多倍体，如三倍体、小基因突变、平衡染色体结构异常等。利用寡核苷酸阵列检测aCGH可检测基因缺失或重复等小基因突变；然而，其他限制在理论上是不可克服的。

为了弥补aCGH的不足，SNP阵列还对PGD和PGS进行了综合分析。具有寡核苷酸的SNP阵列为每个标记提供了一个基因型（即，AA, BB，或AB）。在连锁分析、染色体异常和非整倍体筛选的基础上，已开发出用于单基因疾病PGD的SNP阵列。在非整倍体和亲本互易位检测能力方面，SNP和aCGH技术的诊断效率是一样的。然而，与aCGH不同的是，SNP技术可以检测多倍体和较小的突变。

5 NGS技术

NGS技术的最新进展已经发展到遗传分析的另一个阶段，并被引入到PGD和PGS中[14]。NGS潜在的分析优势包括降低DNA测序成本，增强对部分非整倍体的检测，增强对多细胞样品中嵌合现象的检测，以及实现分析自动化的潜力[15,16]。在NGS和aCGH之间已经证明了可移植胚胎的完全一致性。然而，用于PGD的NGS panel仅能进行5000次非整倍体分析。虽然NGS提供了高分辨率和准确的检测小于14mb片段大小的缺失，它仍然无法检测平衡染色体重排，此外，序列覆盖和实际深度不足以进行等位基因检测[17]。

6 PGS

PGS是PGD的一个子类。PGD的主要目的是为遗传疾病的携带者筛选出基因正常的胚胎。与PGD相比，PGS的目的是改善妊娠和分娩的结局[18]。大多数流产在妊娠早期是由非整倍体引起的；因此，PGS的首要目标是降低流产率。PGS通常用于高龄产妇和反复植入失败的患者，以及反复流产的正常核型患者[19]。PGS有时也用于因为男性不育的夫妇，或者已经生产出患有染色体异常的婴儿的夫妇，也可以用于具有放疗和化疗史的夫妇。自1995年以来，FISH分析在PGS检测中广泛应用，并且aCGH和SNP阵列最近也用于PGS的检测。目前已有研究利用FISH进行卵裂期胚胎（blastomere） PGS检测，结果指出通过移植正常诊断的胚胎，可以提高每次移植的着床率，降低流产率[20-22]。然而，大多数PGS试验都是非随机的研究。2007年Mastenbroek等发表的第一项随机对照研究（RCT）显示，PGS患者的分娩率明显较低[23]。此后发表了许多PGS的随机对照研究，没有证据表明FISH诊断可改善分娩率。

活检的分期和诊断方法可能会影响植入和分娩的比例。在胚胎发育过程中，卵裂期胚胎活检被认为比囊胚活检更具侵袭性。此外，由于染色体重排和/或发育失败，胚泡滋养外胚层的非整倍性发生率可能更低。目前，使用aCGH或SNP阵列的全面染色体分析已被普遍用于代替FISH[24]。

7 伦理学适应症

已确定胚胎植入前遗传诊断是高危人群的一种选择，他们的子女可能患有严重的遗传疾病或残疾；然而，PGD在遗传载体和确保减少流产和其他疾病方面有着广泛的潜在应用。基因检测技术发展出的图谱扩大了PGD适应症的选择范围，这从伦理和法律定义的角度引发了争议。PGD的适应症不仅应根据个人的要求或权利，而且应考虑到各种各样的社会纪律和互助，从生育自主权的角度来决定。

迄今为止，PGD主要应用于高外显率突变引起的疾病，这些突变存在着严重影响新生儿发育的高风险。然而，很难在严重和非严重疾病之间划清界限，许多讨论围绕着PGD适应症是否应该扩展到低外显率突变、迟发性疾病或遗传性残疾。在PGD之前，基因咨询对于支持和确保患者在进入周期之前清楚地了解其优点和缺点是至关重要的。

关于PGD指标的讨论可能无法达成明确的共识。欧洲人类生殖和胚胎学会伦理与法律专责小组认为，如果PGD符合比例标准，那么它在道德上是可以接受的，在讨论PGD可能的适应症时应该考虑心理和关系因素。尽管有争议的迹象仍然存在。如果性别选择的目的是避免跨代传递，那么PGD在道德上是可以接受的，而社会性别选择则被认为是不可接受的。

8 未来展望和总结

尽管PGD是一种成熟的技术，但PGS仍在争论中，随着对人类胚胎发育的更好理解，随着设计更好的前瞻性随机试验获得更多数据，PGS将被临床所接受。临床研究将随着对人类胚胎发育的更好理解而不断发展，可从前瞻性随机试验获得更多数据，如活检时间的影响，不同基因分型方法（包括qPCR，aCGH，SNP阵列和NGS）之间的局限性和比较，以及明确定义的目标人群，如孕妇年龄高的女性或反复流产的女性。通过WGA的改进和NGS分析流程的优化等技术方面的进展预测，可以解决许多当前未解决的问题，但也可能出现更多问题。它需要IVF临床医生，进行活组织检查的胚胎学家以及进行基因分型的遗传学家的共同努力，以使PGS的辩论最终得到解决。在参加IVF+PGD / PGS计划之前，应向所有病例提供非指导性遗传咨询，并提供当时最佳和最新的证据。