一株牛源金黄色葡萄球菌噬菌体VB-SavM-JYL02 生物学特性及基因组学研究

冀亚路，雷连成，冯 新，孙长江，韩文瑜,2*，顾敬敏*

（1.吉林大学动物医学院，吉林 长春 130062；2.江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏 扬州 225000）

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种常见的兼性致病菌，能够引起人和动物多种疾病，包括皮肤脓肿、败血症、以及心内膜炎、肺炎、乳腺炎和脑膜炎[1]，该菌也是引起奶牛乳腺炎的主要病原体之一[2]。长期以来，抗生素治疗（如天然或合成青霉素）是治疗乳腺炎的主要策略，但抗生素的残留物对人类健康造成极大危害。因此，迫切需要寻找新的有效对抗乳腺炎病原体的抗菌药物。

噬菌体是能够感染和杀死细菌的病毒，它能够特异性感染细菌，附着于宿主并通过内部复制和裂解细菌将其杀死[3]。与抗生素不同，噬菌体不会破坏宿主的正常微生物菌群，从而防止了细菌的生态失调，否则可能导致继发感染，因此利用噬菌体抑制细菌生长可能是抗生素的天然、无毒和有效的替代品[4]。有研究表明噬菌体显示出对S. aureus 感染的局部和全身的杀菌活性，并且大大减轻由S. aureus 引起的炎症[5]。此外，有研究表明S. aureus噬菌体K 对治疗由S. aureus 引起的奶牛乳腺炎具有显著功效[6]。依靠良好的生物学特性噬菌体有望成为控制S. aureus 感染的有效抗菌剂。

本研究利用牛源S. aureus SA.1545 从污水中分离得到一株烈性噬菌体，命名为VB-SavM-JYL02。该噬菌体表现出高效的裂解活性和宽宿主谱，基因组内未发现与细菌毒力、抗生素抗性以及与溶原性相关的基因，这些特征均有利于该噬菌体被用作S. aureus 感染的治疗或预防的候选药物。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料本实验所有菌株见表1[菌株名称右上标“1”表示菌株分离于吉林大学第一医院（长春，中国）；右上标“2”表示菌株来自美国典型菌种保藏库；右上标“3”表示菌株购自中国兽医药品监察所；右上标“4”表示实验室保存菌株]。噬菌体宿主菌S. aureus SA.1545 分离于奶牛乳汁。胰蛋白酶大豆肉汤培养基（TSB）购自青岛海博公司；0.22 μm 孔径的Millipore 过滤器购自Millipore 公司（美国）；病毒基因组提取试剂盒购自Doraville 公司（美国）。

1.2 噬菌体的分离与纯化收集污水样本，并通过棉绒过滤。用过滤后的污水配置100 mL TSB 液体培养基，加入1 mL S. aureus SA.1545（OD600nm1），置于37 ℃摇床（165 r/min）过夜培养后通过空斑法[7]检测噬菌体，利用双层琼脂平板法对出现空斑的培养液进行噬菌体的纯化[8]，命名为噬菌体VB-SavMJVL02。将纯化好的噬菌体扩增与甘油按照3:1 的比例混匀后放-80°C 保存。

1.3 噬菌体VB-SavM-JYL02的一般生物学特性测定

1.3.1 噬菌体VB-SavM-JYL02 电镜观察 将纯化后的噬菌体利用800 mL TSB 液体培养基进行大量扩增后，4 ℃8 000 r/min 离心10 min 除去细菌和细菌碎片，收集上清液。将DNase I 和RNase A 以终浓度1 μg/L 加入上清液，室温静置30 min。随后将聚乙二醇8 000 以终浓度0.1 μg/mL 加入上清液，冰上孵育2 h 以上，4 ℃以10 000 r/min离心20 min。噬菌体最终附着到离心管管壁上，弃掉上清液，用3 mL SM缓冲液重悬噬菌体，加入等体积的氯仿萃取，充分混合后用4 ℃离心机以4 000 r/min 离心20 min，重复萃取3次。将浓缩的噬菌体VB-SavM-JYL02 样品采用磷钨酸负染法染色后使用透射电子显微镜观观察形态。

1.3.2 噬菌体VB-SavM-JYL02 最佳感染复数（MOI）测定 将宿主菌SA.1545在TSB液体培养基中培养至对数生长期（OD600nm=0.6），调整菌落数至1×108cfu/mL，分别按照MOI 0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10、100的比例加入不同量的噬菌体，37 ℃180 r/min 振荡培养8 h。分别取其培养液，4 ℃10 000 r/min 离心2 min，过滤后10 倍倍比稀释，通过双层琼脂平板法测定噬菌体滴度，以确定噬菌体最佳MOI，试验重复3 次。

1.3.3 噬菌体VB-SavM-JYL02 的一步生长曲线测定

将S. aureus SA.1545 在TSB 液体培养基中培养至对数生长期（OD600nm=0.6），取1 mL 菌液离心后弃去上清液，用等体积新鲜的TSB 培养基重悬沉淀。以上述筛选的最佳MOI 加入噬菌体，使其在37°C 吸附10 min。将混合物4 ℃10 000 r/min离心15 min，随后将沉淀物重新悬浮于5 mL 新鲜TSB 培养基中37 ℃180 r/min 振荡培养70 min，每10 min 取100 μL 培养液，10 倍倍比稀释后，通过双层琼脂平板法测定噬菌体滴度，绘制噬菌体生长曲线，试验重复3 次。

1.3.4 噬菌体VB-SavM-JYL02 的宿主谱测定 通过空斑法和双层琼脂平板法测定噬菌体的宿主谱。观察噬菌体在涂有菌液的固体培养基上是否产生空斑或噬菌斑，以确定该噬菌体对所测菌株是否有裂解活性。共选取50 株菌（包括4 株表皮葡萄球菌和46 株S.aureus）用于噬菌体VB-SavM-JYL02 的宿主谱测定。

1.4 噬菌体VB-SavM-JYL02 基因组测序及其同源性比对分析利用IlluminaHiSeq 2500 测序平台对噬菌体VB-SavM-JYL02 进行全基因组测序；利用SOAPdenovo 软件拼接噬菌体VB-SavM-JYL02 基因组序列对并其进行生物信息学分析；利用BLAST 和GeneMarkS 预测和分析噬菌体VB-SavM-JYL02 潜在的开放阅读框（ORF）；利用CLC Main Workbench ver⁃sion 7.7.3 软件制作噬菌体VB-SavM-JYL02 基因功能模块图谱；利用BLAST 比对与噬菌体VB-SavMJYL02 全基因组序列同源性较高的噬菌体，并利用Mauve 2.3.1 软件对其比较分析。

2 结 果

2.1 噬菌体的分离和纯化利用牛源S. aureus⁃SA.1545 从污水中分离出一株噬菌体，利用双层平板法纯化3 代后，获得直径大小为1 mm～2 mm，边缘整齐透亮，无晕环透明圆斑样噬菌斑（图1）。表明该噬菌体具有较强的裂解活性，命名为噬菌体VB-SavM-JYL02。

图1 噬菌体VB-SavM-JYL02 纯化后在双层板上产生的噬斑，直径约1 mm～2 mmFig.1 The plaques produced by the phage VB-SavM-JYL02 on the double-layer plate after purification, about 1 mm-2 mm in diameter

2.2 噬菌体VB-SavM-JYL02 的生物学特性测定结果噬菌体VB-SavM-JYL02 浓缩后经电镜观察可见该噬菌体头部呈正二十面体，头部直径为85 nm～90 nm，尾部长约180 nm～190 nm，且尾部可收缩。噬菌体VB-SavM-JYL02 从形态学上分析属于有尾病毒目，肌尾病毒科（图2）。当MOI 为0.01 时，噬菌体VB-SavM-JYL02 的效价最高，约达到5.2×109pfu/mL（图3）。一步生长曲线结果显示噬菌体VB-SavMJYL02 具有较短的潜伏期，约为20 min，爆发期约为20 min，一个裂解周期约为40 min（图4），表明噬菌体有很强的杀菌效率。

利用空斑法和双层琼脂平板法测定噬菌体VBSavM-JYL02 的宿主谱。空斑法结果显示噬菌体VBSavM-JYL02 在所有50 株测试菌株的平板上均能产生空斑，双层琼脂平板法检测结果显示噬菌体VBSavM-JYL02 能在其中32 株菌（包括2 株表皮葡萄球菌和30 株S. aureus）的双层琼脂平板上产生噬菌斑，表明噬菌体能够裂解其中32 株葡萄球菌，具有很宽的宿主谱，裂解率为64%（32/50）（表1）。

图2 噬菌体VB-SavM-JYL02 的透射电镜图，比例尺代表100 nmFig.2 Transmission electron microscope image of phage VB-SavM-JYL02, scale bar represents 100 nm

图3 噬菌体VB-SavM-JYL02 的最佳MOI 的测定Fig.3 Optimal multiplicity of infection (MOI) determination of phage VB-SavM-JYL02

图4 噬菌体VB-SavM-JYL02 的一步生长曲线测定Fig.4 One-step growth curve determination of phage VB-SavM-JYL02

2.3 噬菌体VB-SavM-JYL02 基因组学分析经测序及拼接后，噬菌体VB-SavM-JYL02 的完整基因组序列上传至GenBank（MK250904.1）。噬菌体VBSavM-JYL02 的基因组属于线性双链DNA，全长141 384 bp，G+C 含量30.18%，共编码218 个ORF。利用软件制作噬菌体VB-SavM-JYL02 基因功能模块图谱（图5）。每个箭头代表编码蛋白质的ORF，箭头的方向代表基因转录方向。大多数噬菌体基因是正向转录的（20～181 个ORF），其余均为逆向转录。将所有ORF 分为6 大类，包括核苷酸代谢和复制、宿主裂解、形态发生、DNA 包装、病毒代谢相关及假定蛋白质，在所有鉴定的ORF 中，该噬菌体与已知功能蛋白质具有高度相似性的72 种基因产物暂时被赋予相应的功能，其中宿主裂解相关基因位于ORF13 和ORF14，末端酶大亚基位于ORF23。未发现与抗药性、致病性或溶原性相关的基因序列，这有利于该噬菌体用于治疗性药物的研发。

表1 VB-SavM-JYL02 的宿主谱Table 1 Host rangeof VB-SavM-JYL02

图5 噬菌体VB-SavM-JYL02 全基因组分析Fig.5 Whole genome analysis of phage VB-SavM-JYL02

经BLAST 比对分析，噬菌体VB-SavM-JYL02 在基因组水平上与S. aureus 噬菌体VB-SavM-JYL01（MH159197.1）、vB_SauM_LM12（MG721208.1）、SA3（MF001365.1）、P108（KM216423.1）、phiIPLA-RODI（KP027446.1）、GH15（JQ686190.1）、qdsa002（KY77 9849.1）、JD007（JX878671.1）及S25-4（AB853331.1）具有高度同一性。利用Mauve 2.3.1软件对其进行比对分析（图6），序列相似性由不同颜色条柱的高度表示，其对应于基因组序列中该区域中的平均保守水平。噬菌体VB-SavM-JYL02与同源噬菌体的基因组共线性分析结果显示，这10个S.aureus噬菌体存在及其相似的基因模块排布顺序，不同噬菌体保有其特异性序列，显示出S.aureus噬菌体的基因组排布特征，表明噬菌体基因组存在种属关联性与个体特异性。

图6 噬菌体VB-SavM-JYL02 与同源噬菌体基因组共线性分析Fig.6 Co-linear analysis of phage VB-SavM-JYL02 and homologous phages

3 讨 论

噬菌体作为抗菌剂具有很大的潜力成为替代抗生素候选物。噬菌体疗法已经在动物感染模型的治疗试验中获得了一定的成功，可能成为治疗牛乳腺炎的一种有效的替代疗法。因此，筛选安全性高，杀菌活性强的牛源S. aureus 噬菌体尤为重要。

本研究利用牛源S. aureus SA.1545 从污水中分离得到一株新的噬菌体VB-SavM-JYL02，该噬菌体在体外表现出高效的裂解活性。噬菌体形态与已报道的S. aureus 噬菌体VB-SavM-JYL01、GH15、K 以及MSA6 相似[9-10]。其中噬菌体MSA6 是从患有乳腺炎的奶牛中分离出来，具有较宽的宿主谱，能够裂解与牛乳腺炎相关的致病葡萄球菌以及与人类感染相关的耐抗生素S. aureus[9]。而噬菌体VB-SavM-JYL02同样具有宽宿主谱（64%），同样能够裂解一些与人类感染相关的临床致病菌株。全基因组比对结果显示噬菌体VB-SavM-JYL02 与VB-SavM-JYL01 同源性为100%[11]，但是VB-SavM-JYL02 与VB-SavM-JYL01裂解谱却有差异，两者虽然都能在所测试的50 株葡萄球菌产生空斑，但VB-SavM-JYL02 能够裂解葡萄球菌R066、R002、J2 和SL1，VB-SavM-JYL01 则不能裂解这4 株菌，而VB-SavM-JYL01 能够裂解葡萄球 菌W074、 R027、 W4552、 R3790、 R3659 和R6199，VB-SavM-JYL02 则不能裂解这6 株葡萄球菌[11]，这可能与噬菌体基因组内其他未表征的假定蛋白有关。此外，噬菌体VB-SavM-JYL02 与GH15和K 的同源性分别为99%和96%，但噬菌体VBSavM-JYL02 的宿主谱却比GH15 和K 要宽很多，而尾丝蛋白氨基酸序列比对结果显示噬菌体VBSavM-JYL02 与GH15 和K 的同源性都为92%，尾丝蛋白氨基酸序列的差异可能导致宿主谱的差异[12]。

总之，噬菌体VB-SavM-JYL02 具有高效裂解活性和宽宿主谱，以及基因组中不存在与细菌毒力、抗生素抗性以及溶原相关的基因，这些特点都有利于该噬菌体用于S. aureus 感染引起的奶牛乳腺炎及相关疾病的预防和治疗。