杨 卓,邱振南,余晓愉,周文佳,闫春晓,齐新宇,徐无忌,熊 辉*
(1.湖南中医药大学,湖南 长沙410208;2.浏阳市中医院,湖南 浏阳410301;3.湖南中医药大学第二附属医院,湖南 长沙410005)
随着人们生活节奏的加快及交通水平的不断提高,骨折成了临床的常见病、多发病,各种并发症的概率也在逐渐增加[1-2]。 由于骨折的愈合是一个漫长的过程,所以国内外学者针对中医药促进骨折愈合进行了大量相关研究[3]。 桃红四物汤载于清代医家吴谦所著之《医宗金鉴》,是活血化瘀的代表方之一。本课题组前期研究表明,该方具有良好的促进早期骨折愈合的作用,主要表现在促进成骨细胞生长、加速骨小梁重建、促进骨痂微血管新生、提高骨痂血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)蛋白的表达[4]。王慧卓等[5]研究发现,大鼠灌胃桃红四物汤后,液相色谱-串联质谱法测得血液中有效单体成分主要有芍药苷、芍药内酯苷、梓醇、阿魏酸、藁本内酯和苦杏仁苷6 种。本研究拟从桃红四物汤中药物主要有效单体成分配伍角度,探讨其对大鼠早期骨折愈合的影响及其作用机制。
SPF 级健康2 月龄SD 雄性大鼠60 只,体质量为(200±20) g,订购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司,动物合格证号:SYXK<湘>2016-0002。 各组大鼠均分笼饲养于湖南中医药大学实验动物中心,温度20~25 ℃,相对湿度55%~60%,自由摄食饮水。
4%的乙二胺四乙酸(EDTA)(上海生工生物工程有限公司),鼠VEGF 试剂盒(上海森雄科技实业有限公司,G-W054),桃红四物汤单体成分组方:苦杏仁苷(MUST-18042810)、阿 魏 酸(MUST-18032928)、羟基红花黄色素A(MUST-18101910)、梓醇(MUST-18103011)、芍药苷(MUST-18032901)、毛蕊花糖苷(MUST-18032725)、川芎嗪(MUST-18051403),以上成分均由成都曼斯特生物科技有限公司提供,根据2015 版《中药药典》的剂量将苦杏仁苷35 mg、阿魏酸2.5 mg、羟基红花黄色素A 15 mg、梓醇3 mg、芍药苷31 mg、毛蕊花糖苷1 mg、川芎嗪1.5 mg 溶于水配成单体组方,和桃红四物汤水煎剂等体积灌胃。 桃红四物汤:桃仁20 g,红花10 g,生地黄20 g,当归20 g,赤芍20 g,川芎10 g,由湖南省第二附属医院中药房提供,符合2015 版《中华人民共和国药典》要求。药物制备:加10 倍量水浸泡0.5 h,用电热套加热回流提取1 h,趁热滤过;第2 次加8 倍量水,同法再煮1 h。合并两次煎液,药物浓缩至每1 mL中含复方中药0.6 g。
ER-182 A 型电子天平(日本AND 公司),显微镜(日本Motic 公司 ),石蜡切片机(德国LABSTAR公司),旋转蒸发器RE-2000B(上海亚荣生化仪器厂),显微CT(美国Perkin Elmer 公司)。
将60 只SD 雄性大鼠饲养1 周后,参照文献[6]造模,具体方法如下:腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉大鼠后,取俯卧位将大鼠固定于无菌操作台上。 备皮,常规消毒。 于大鼠左股外侧作一长约3 cm 的纵行切口,逐层钝性分离后充分暴露股骨干;定位至股骨干中段,先用骨锯锯断股骨,后改用止血钳折断股骨干,以保持断端完整。由断端进针,同侧股骨大转子出针,于股骨干近端逆行插入一根直径为1 mm的克氏针复位,然后顺行穿回,完成复位后,弯折其根部,剪去多余部分,随后缝合伤口。 术中剔除粉碎性骨折大鼠,重新造模补充至所需样本量。 观察大鼠情况,确认无术后死亡后回笼饲养,正常饮水摄食,予青霉素腹腔注射3 d,防止感染。 将大鼠随机分为5 组,每组12 只:空白组(A 组,不做处理,灌胃等量生理盐水)、假手术组(B 组,只切开不截断,灌胃等量生理盐水)、模型组(C 组,造模,灌胃等量生理盐水)、原方水提组(D 组,造模,灌胃原方水煎剂)、单体成分组(E 组,造模,灌胃原方主要单体成分组方)。
大鼠每日灌胃量为3 mL/只,剂量为9 g/(kg·d)。原方水提组及单体成分组按等剂量灌胃相应药液;模型组、假手术组及空白组灌胃等量的生理盐水。各组连续灌胃10 d,每天灌胃2 次,2 次灌胃间隔8 h。
在大鼠造模后第4、7、10 天,每组随机选择4 只大鼠,麻醉后经腹主动脉采血后用断颈处死大鼠,取出左侧股骨(造模处),多聚甲醛固定,固定后脱钙。
分别于造模前和造模后第4、7、10 天在左股骨中段同一位置剔除毛发,用红线缠上进行标记,并用不锈钢带表卡尺测量,每只大鼠均需要重复3 次,得到平均值。
造模后第4、7、10 天使用ELISA 检测各组大鼠血清VEGF 的浓度,每组检测4 只,取平均值,具体操作按说明书进行。
通过显微CT(Micro-CT)进行扫描,将造模后第4、7、10 天大鼠股骨中段骨折位置和骨折处周围的骨进行三维重建分析,可测得骨体积(bone volume, BV)和骨性骨痂体积(total volume, TV)百分比(BV/TV%)。
用75%、85%、95%、100%的乙醇梯度依次脱水各30 min,二甲苯透明,浸蜡,石蜡包埋,切片,HE染色,光镜下分别观察造模后第4、7、10 天骨折断端病理形态变化。
与空白组比较,假手术组肢体肿胀度差异无统计学意义(P>0.05),模型组、原方水提组、单体成分组肢体肿胀度在造模后、灌胃第4、7 天大鼠肢体肿胀度均显著增加(P<0.05),原方水提组、单体成分组在灌胃第10 天差异无统计学意义(P>0.05)。与模型组相比,单体成分组与原方水提组大鼠肢体肿胀度在造模后差异无统计学意义(P>0.05),在灌胃第4、7、10 天明显降低(P<0.05)。 与原方水提组比较,单体成分组肢体肿胀度在造模后、灌胃第4、7、10 天差异均无统计学意义(P>0.05)。 见表1。
表1 大鼠股骨中段肿胀度变化(n=4,±s,cm)
表1 大鼠股骨中段肿胀度变化(n=4,±s,cm)
注:与空白组比较,★P<0.05;与模型组比较,●P<0.05
组别空白组假手术组模型组原方水提组单体成分组灌胃第10 天4.12±0.33 4.10±0.41 4.93±0.29★4.21±0.40●4.17±0.32●造模后4.04±0.42 4.51±0.56 5.52±0.38★5.45±0.25★5.46±0.33★灌胃第4 天4.07±0.24 4.42±0.47 5.37±0.55★4.95±0.43★●4.81±0.51★●灌胃第7 天4.10±0.54 4.29±0.23 5.01±0.40★4.63±0.21★●4.72±0.53★●
与空白组比较,假手术组大鼠血清VEGF 浓度差异无统计学意义(P>0.05),模型组、原方水提组、单体成分组大鼠血清VEGF 浓度在灌胃第4、7、10天均显著增加(P<0.05)。 与模型组比较,原方水提组、单体成分组大鼠血清VEGF 浓度在灌胃第4、7、10 天均显著增加(P<0.05)。 与原方水提组比较,单体成分组大鼠血清VEGF 浓度在灌胃第4、7、10 天差异均无统计学意义(P>0.05)。 见表2。
表2 不同时相点血清VEGF 浓度含量统计分析(n=4,±s)
表2 不同时相点血清VEGF 浓度含量统计分析(n=4,±s)
注:与空白组比较,★P<0.05;与模型组比较,●P<0.05
组别空白组假手术组模型组原方水提组单体成分组灌胃第4 天123.65±3.61 130.17±1.67 162.32±5.34★235.18±5.09★●229.34±3.82★●灌胃第7 天122.76±2.73 125.30±2.54 197.90±7.79★335.56±4.71★●341.38±5.84★●灌胃第10 天124.04±1.89 123.15±3.01 225.68±2.54★476.74±3.82★●462.31±5.22★●
与模型组比较,原方水提组、单体成分组BV、BV/TV%在灌胃第4、7、10 天均显著增加(P<0.05)。与原方水提组比较,单体成分组BV、BV/TV%在灌胃第4、7、10 天差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3-4、图1。
表3 大鼠术后BV 变化(n=4,±s)
表3 大鼠术后BV 变化(n=4,±s)
注:与模型组比较,▲P<0.05
组别模型组原方水提组单体成分组灌胃第4 天38.12±3.64 44.35±4.59▲46.23±3.34▲灌胃第7 天42.56±3.12 53.23±3.24▲54.21±3.71▲灌胃第10 天50.12±4.72 76.43±3.89▲78.52±4.76▲
空白组和假手术组的骨皮质和骨干连续未断,可见充满骨髓的海绵状骨。灌胃第4 天,模型组可见不连续的骨皮质和骨干以及局部坏死的骨组织;原方水提组和单体成分组中均可以见到少量的软骨细胞和肉芽组织。灌胃第7 天,模型组、原方水体组、单体成分组中均可见大量软骨细胞和肉芽组织,此外,原方水提组还可见少许骨小梁,单体成分组还可见少许的骨小梁和骨髓腔。 灌胃第10 天,模型组可见大量的软骨细胞和肉芽组织,未见骨痂;原方水提组和单体成分组均可见少许骨痂,骨痂内有新生骨小梁且排列致密。 见图2。
表4 大鼠术后BV/TV%变化(n=4,±s)
表4 大鼠术后BV/TV%变化(n=4,±s)
注:与模型组组比较,▲P<0.05
组别模型组原方水提组单体成分组灌胃第4 天0.21±0.04 0.33±0.06▲0.36±0.05▲灌胃第7 天0.24±0.05 0.47±0.02▲0.42±0.07▲灌胃第10 天0.35±0.06 0.58±0.09▲0.59±0.08▲
图1 术后第4、7、10 天大鼠股骨显微Micro-CT 图像
图2 术后第4、7、10 天大鼠股骨切片(HE,×40)
骨折愈合是一个复杂的过程,是通过细胞、生长因子和生物途径之间的相互作用来协调的[7],通过骨折部位处募集祖细胞,促进形成初始软骨痂,然后被血管再吸收、骨形成和骨化最终达到骨折愈合[8]。骨折修复失败一直是困扰骨科医生的重要难题[9],中医药治疗骨伤科疾病有着独特优势,尤其在治疗骨损修复方面,一直是临床骨科研究的重要领域[10]。现代药理研究表明[11],桃仁中的有效成分苦杏仁苷能发挥抗炎作用,其机制可能与通过脂蛋白刺激小鼠小胶质细胞BV-2 中环氧合酶2,并促进一氧化氮合酶mRNA 的表达有关。 红花中的有效成分羟基红花黄色素A,能拮抗二磷酸腺苷的促血小板聚集作用[12],通过竞争性抑制血小板激活因子,正向调控VEGF 的表达,进一步促进血管的新生。 桃红四物汤含有大量多糖成分,有助于增加造血微循环中的白细胞、红细胞和血小板的含量,还能刺激肌组织中的造血调控因子,提高外周血中白细胞含量[13-14]。研究表明[15],阿魏酸具有抗炎、抗血栓、抗氧化、抑制血小板聚集等药理作用。 芍药苷能够抗炎止痛、扩张血管、增加血流量、抑制血小板聚集。川芎嗪具有明显的抗氧化损伤的作用,能增加组织中的毛细血管数,改善微血管内血液流变性,改善损伤组织血运状态,加速骨折愈合。梓醇溶液能显著促进成骨细胞增殖。通过实验也证实了桃红四物汤单体成分配伍加速了骨折愈合[16]。
VEGF 在内皮细胞活化、增殖、迁移、改善血管通透性等过程中均起重要作用。血管生成是成骨过程中的关键环节,VEGF 又是调控血管发育和血管生成的重要生长因子之一。因此,调控VEGF 表达是修复骨损伤和促进骨再生的重要靶点之一。 本实验研究发现,与模型组相比,原方水提组与单体成分组VEGF 浓度在灌胃第4、7、10 天均显著升高;与原方水提组相比,单体成分组VEGF 浓度在灌胃第4、7、10 天未见明显差别。证实了桃红四物汤有效单体成分组方可以促进VEGF 的表达。
BV/TV%及BV 是评价骨折断端生长情况的标志[17]。分析Micro-CT 结果发现,桃红四物汤单体成分组方能有效促进大鼠早期骨折愈合。骨组织病理学检测也进一步证实了这一结果,通过观察灌胃第4、7、10 天病理切片我们发现,原方水提组和单体成分组大鼠软骨细胞的生长、骨小梁与骨髓腔的形成、骨折愈合的速度均快于模型组。
综上所述,通过对大鼠一般情况、肢体肿胀度、血清VEGF 浓度、Micro-CT 和组织病理切片的观察、检测和分析,本次实验有效证实了桃红四物汤单体成分配伍有助于促进大鼠骨折早期愈合,但具体机制尚需进一步研究。 此外,本实验仅对3个时间点的结果进行分析,样本量较小,桃红四物汤单体成分组方是否可以完全替代原方水煎剂还需进一步实验研究。