补中益气汤对PC12 细胞线粒体DNA 部分缺失模型的保护作用

李腾辉，董一昕，闫凤娜，王淑艳，王珊珊，于 雪，王 旭，许明阳，李卫红*

（1.北京中医药大学中医学院，北京100029；2.首都医科大学附属北京地坛医院，北京100020）

中医学认为气是构成人体和维持人体生命活动的最基本物质，人体的精微物质血、津液和精等均由气所化生[1]。气通过推动、温煦作用，对人体的生长发育以及各脏腑组织器官的生理活动均具有激发和促进作用[2]。线粒体通过氧化磷酸化过程合成ATP，为细胞的各种生命活动提供能量，是人体“动力工厂”。当线粒体功能障碍时，机体会出现“气虚”的相关症状。由于中医“气”和线粒体在功能和病理表现上的高度一致性，有学者提出了“气-线粒体”相关学说[3-4]，提示改善线粒体损伤可能是补气药物发挥疗效的内在机制。

中枢神经系统代谢旺盛，能量需求高，神经细胞线粒体含量丰富[5]。线粒体是除了动物细胞核之外唯一含有DNA 的细胞器，但由于线粒体DNA（mtDNA）缺乏组蛋白的保护，极易受到氧自由基等因素损伤发生缺失突变，导致线粒体能量代谢功能异常[6]。因此，本实验采用具有神经细胞特征的PC12 细胞，通过建立mtDNA 部分缺失细胞模型，观察补中益气汤对线粒体损伤的作用及其内在机制，为揭示中医“补气”疗法的生物内涵提供实验依据。

1 材料

1.1 药物

补中益气汤：黄芪15 g，炙甘草15 g，人参9 g，当归6 g，陈皮6 g，升麻6 g，柴胡6 g，白术9 g，均购自北京同仁堂。补中益气汤母液制备：将补中益气汤饮片加适量水浸泡0.5 h，煎煮两次，合并两次药液浓缩至含生药315 mg/mL 的母液，过滤除菌4 ℃保存备用。 达纳康母液制备：达纳康作为阳性对照药，制备成总有效成分0.4 mg/mL 的母液，4 ℃保存以备用。

1.2 细胞

PC12 细胞（大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞株）购自北京协和细胞库。

1.3 主要试剂与仪器

DMEM、胎牛血清(Gibco 公司)；马血清（拜尔迪公司）；溴化乙锭（兰博利德公司）；丙酮酸、尿嘧啶（Sigma 公司）；CCK8 试剂盒（碧云天公司）；线粒体呼吸链复合物Ⅰ-Ⅳ活性检测试剂盒（索莱宝公司）；ATP 检测试剂盒（碧云天公司）；DNA 提取试剂盒（艾科瑞公司）；RNA 检测试剂盒（艾科瑞公司）。

实时荧光定量PCR 仪（美国Bio-Rad 公司）；CO2培养箱（德国Eppendorf 公司）；酶标仪（美国BioTek公司）。

2 方法

2.1 PC12 细胞mtDNA 部分缺失模型建立

2.1.1 细胞活性检测 将PC12 细胞按5×105/mL 密度接种于96 孔板，待细胞生长至对数期，吸弃旧培养基，除正常对照组外，其余各组加入不同终浓度（125、250、500、1 000、2 000 ng/mL）溴化乙锭，以及100 μg/mL 丙酮酸，50 μg/mL 尿嘧啶的培养基，48 h 后将细胞按照1×105/mL 密度接种于96 孔板中，每组设定6 个复孔，进行CCK8 检测。 最终确定溴化乙锭的浓度为500 ng/mL 用于后续实验。

2.1.2 mtDNA 拷贝数检测 为证实mtDNA 的缺失情况，采用RT-PCR 法检测线粒体单拷贝基因环氧合酶2（COX2）来代表mtDNA 拷贝数。500 ng/mL 浓度溴化乙锭造模完成后，收集细胞，采用DNA 提取试剂盒提取细胞DNA，检测DNA 质量并测定浓度。扩增COX2 基因，引物大小为156 bp，正向引物序列为5′-TGGCTTACAAGACGCCACAT-3′，反向引物序列为5′-TGGGCGTCTATTGTGCTTGT-3′，核编码基因β-actin 作为内参，引物大小为262 bp，正向引物序列为：5′-TTACTGCCCTGGCTCCTAG-3′，反向引物序列为5′-CGTACTCCTGCTTGCTGATC-3′。反应体系为2×SYBR Green Mix 10 μL，DNA 1 μL，引物各0.5 μL，ddH2O 8 μL，扩增程序为95 ℃预变性10 min，95 ℃变性10 s，55 ℃退火30 s，65 ℃延伸5 s，49 个循环。 采用2-△△Ct法进行结果计算。

2.2 实验细胞分组与处理

将PC12 细胞分为4 组：正常组、模型组、达纳康组、补中益气汤组。除正常组外，其余3 组按“2.1”方法造模。造模完成后，模型组更换为无血清DMEM基本培养基。前期预实验筛选出补中益气汤和达纳康的给药浓度分别为16 mg/mL、100 ng/mL。补中益气汤组和达纳康组按照预实验筛选出的药物浓度进行给药干预，24 h 后进行指标检测。

2.3 指标检测

2.3.1 细胞活性检测 细胞分组处理完成后，吸弃旧培养基，用PBS 溶液轻柔清洗2 遍，加入90 μL DMEM 培养基和10 μL CCK8 检测液，37 ℃孵育3 h，用酶标仪测定每孔在450 nm 处的OD 值。

2.3.2 线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性和ATP 含量测定 细胞分组处理完成后，用线粒体呼吸链复合物活性检测试剂盒及ATP 检测试剂盒，比色法检测各组细胞线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ含量，具体操作严格按照试剂盒说明书上的实验步骤进行。

2.3.3 线粒体转录因子A（mitochondrial transcription factor A, TFAM）mRNA 水平检测 各组药物作用完成后，收集细胞，采用RNA 提取试剂盒提取细胞总RNA，测定RNA 浓度并检测纯度。采用反转录试剂盒将RNA 反转录为cDNA 模板，反转录反应条件：37 ℃，15 min；85 ℃，4 s，TFAM 引 物 大 小 为148 bp， 正向引物序列为5′-TTAGAGAAGGAAGC CCGGCA-3′， 反 向 引 物 序 列 为5′-GTGACTCATC CTTAGCCCCC-3′。内参GAPDH 引物大小为153 bp，正向引物序列为5′-CCATTCTTCCACCTTTGAT-3′，反向引物序列为5′-TGGTCCAGGGTTTCTTACT-3′。反应体系为2×SYBR Green Mix 10 μL，cDNA 1 μL，引物各0.5 μL，ddH2O 8 μL，反应程序及结果计算方法同“2.1.2”。

2.4 统计学方法

3 结果

3.1 mtDNA 部分缺失模型中溴化乙啶浓度的确定

与正常组比较，溴化乙啶各浓度组OD 值均降低(P＜0.001)，呈现出线性量效关系，表明溴化乙锭引起线粒体活性下降。实验中发现，由于溴化乙锭对细胞毒性较大，1 000 ng/mL、2 000 ng/mL 浓度组细胞造模后死亡较多，药物治疗很难挽救，故选择中间剂量500 ng/mL 溴化乙啶作为本实验的造模浓度。见表1。

表1 不同浓度溴化乙啶对PC12 细胞活性的影响（±s,n=6）

表1 不同浓度溴化乙啶对PC12 细胞活性的影响（±s,n=6）

注：与正常组比较，**P＜0.001

组别正常组125 ng/mL 250 ng/mL 500 ng/mL 1 000 ng/mL 2 000 ng/mL OD 值1.55±0.07 0.77±0.05**0.50±0.05**0.41±0.06**0.35±0.02**0.33±0.02**

3.2 mtDNA 拷贝数检测

正常组细胞形态呈椭圆状或锥形，折光性良好，细胞贴壁性好，有聚成小团簇状生长的倾向（图1A）；模型组细胞贴壁性较差，部分细胞悬浮在培养液中，提示出现细胞损伤状态（图1B）。

图1 细胞形态图（×100）

与正常组相比，模型组PC12 细胞COX2 基因表达明显下降（P＜0.01），提示mtDNA 拷贝数下降，表明500 ng/mL 浓度溴化乙锭造模造成了PC12 细胞线粒体部分DNA 缺失。 见图2。

3.3 各组细胞线粒体活性的检测结果

图2 mtDNA 拷贝数检测结果

与正常组比较，模型组细胞线粒体活性显著升高（P＜0.01）。与模型组相比，达纳康组和补中益气汤组细胞活性显著升高（P＜0.01），提示补中益气汤可以改善mtDNA 缺失造成的细胞活性下降。 见表2。

表2 各组PC12 细胞线粒体活性检测结果（±s,n=10）

表2 各组PC12 细胞线粒体活性检测结果（±s,n=10）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，▲▲P＜0.01

组别正常组模型组达纳康组补中益气汤组OD 值2.27±0.27 0.52±0.11**2.02±0.22▲▲2.14±0.17▲▲

3.4 线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性检测结果

与正常组比较，模型组线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性均显著下降，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组比较，达纳康组和补中益气汤组线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ活性显著升高（P＜0.01），复合物Ⅲ活性有升高趋势，但组间无显著差异，结果见图3。

3.5 各组细胞线粒体ATP 含量

与正常组比较，模型组细胞ATP 含量显著下降，差异有统计学意义(P＜0.001)；与模型组比较，达纳康组和补中益气汤组细胞线粒体ATP 含量显著回升(P＜0.001)，表明两种药物干预后细胞线粒体能量代谢功能有所恢复。 见表3。

3.6 TFAM mRNA 表达水平

与正常组比较，模型组TFAM mRNA 表达水平降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，达纳康组和补中益气汤组TFAM mRNA 表达显著升高（P＜0.01）。 见图4。

4 讨论

中医理论认为气是一种肉眼不可见的精微物质，可以通过生理功能和病理现象来感知生命物质的存在[7]。 现代研究认为，线粒体是细胞进行能量代谢的主要场所，线粒体呼吸链经过一系列的电子和氢离子传递产生ATP，可以为细胞生存提供95%以上能量，对所在组织、器官和生命质量产生重要影响[8]。正如气一样人体生命状态会随着线粒体功能的变化而改变，线粒体也载负着生命现象。故中医学中的气与线粒体功能和作用的统一性逐渐成为现代中医学者的共识[7-9]。

表3 各组细胞ATP 含量（±s,n=6,nmol·L-1）

表3 各组细胞ATP 含量（±s,n=6,nmol·L-1）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，▲▲P＜0.01

ATP 含量836.16±12.76 244.17±8.00**804.60±13.55▲▲815.70±16.70▲▲组别正常组模型组达纳康组补中益气汤组

图4 各组TFAM mRNA 表达水平

脑为“元神之府”，主宰人体的生命活动。随着机体衰老，髓减脑消，神机失用会对人的生活质量造成极大的影响。有报道指出，老年小鼠的脑和海马组织内mtDNA 缺失的比例较青年幼鼠明显增加，mtDNA缺失与年龄相关的退行性病变的发生密切相关[10-11]。由于mtDNA 没有内含子，任何形式的突变都可能会造成mtDNA 序列改变，导致线粒体能量生成障碍，出现学习记忆功能降低、精神意识障碍等现象[12]。因此，有人认为mtDNA 突变可能是导致衰老和神经退行性疾病的重要因素[13]。为探讨大脑mtDNA 缺失对线粒体的功能影响，本实验采用PC12 大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞株（它具有神经内分泌细胞的一般特征，被广泛应用于神经药理研究）建立了mtDNA 部分缺失细胞模型。造模采用经典的溴化乙锭诱导法，溴化乙锭可插入mtDNA 内部，逐步减少mtDNA 的复制，但不影响核DNA 的复制[14]。 以往线粒体mtDNA 研究多采用线粒体缺失细胞株Rho0(ρ0)，即通过长时间的溴化乙锭干预造成mtDNA 完全缺失[15]，这种“全或无”细胞模型无法研究mtDNA不同拷贝数对疾病的影响，不适用于衰老、疲劳综合征等线粒体部分受损疾病的研究[16]。 故本实验采用500 ng/mL 浓度的溴化乙锭进行造模，并通过检测mtDNA 拷贝数证实该浓度可造成mtDNA 部分缺失，建立更适于中医“气虚证”相关疾病研究的mtDNA 部分缺失模型。

线粒体呼吸链通过一系列递氢、递电子反应和氧化还原反应形成能量提供给细胞[17]，一定程度上体现了气的推动作用。 本实验采用李东垣创立的补气代表方“补中益气汤”作为治疗药物[18-19]，观察它对线粒体功能的影响。前期预实验发现，在到达最佳给药浓度之前，补中益气汤组和达纳康组细胞活性会随药物浓度的升高而增强，之后二者呈反比关系，提示两个治疗药物在一定范围内对细胞活性有改善作用。与正常组相比，模型组的线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ活性和ATP 含量明显下降，提示mtDNA部分缺失导致线粒体呼吸功能障碍可能与这3 个复合物有关。线粒体复合物Ⅰ的7 个亚基、复合物Ⅳ的2 个亚基和ATP 合酶F0 结构的2 个亚基由mtDNA自己编码，受mtDNA 缺失影响较大。 与模型组相比，补中益气汤可显著增强呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ活性，这可能是补中益气汤改善线粒体功能的作用环节之一。复合物Ⅰ主要把氢或电子从辅酶I（NADH）传递给辅酶Q（CoQ），同时将4 个氢离子从线粒体内膜内侧泵到膜间隙，复合体Ⅱ的主要功能是将电子从琥珀酸传递给CoQ，然后传递给复合物Ⅲ，再通过Cytc 将电子传递到复合体Ⅳ， 驱动ADP 和Pi合成ATP[20]。 与模型组相比，补中益气汤组ATP 含量增高，与阳性药达纳康效果相近，提示线粒体呼吸链整体功能改善。

TFAM 是一种由细胞核基因编码的线粒体蛋白质。 TFAM 可以通过包裹mtDNA，形成类似组蛋白的核样结构，使其免受氧化损伤，同时促进mtDNA的复制，调节拷贝数，起到保护mtDNA 的作用[21]。线粒体功能紊乱与许多线粒体疾病、肿瘤的发生发展、神经退行性疾病和衰老等密切相关,TFAM 在相关疾病的治疗中起到了关键作用[22]。 有报道称在前脑神经细胞中TFAM 的基因敲除可导致mtDNA 和线粒体转录的减少以及严重的呼吸链缺陷，从而导致神经退行性疾病和明显的行为失调[23]。 本实验结果显示，与模型组相比，补中益气汤组的TFAM 表达显著提高，提示上调TFAM 表达可能是补中益气汤发挥线粒体保护作用的内在机制之一。

综上所述，本实验通过观察补中益气汤对PC12细胞mtDNA 部分缺失模型的影响，发现补气药物可能通过改善线粒体呼吸链功能和mtDNA 修复对线粒体损伤起到保护作用，为补气药治疗mtDNA 部分缺失引起的相关疾病提供了实验依据。另一方面，通过“以药测证”的方法验证了中医气与线粒体之间的密切相关性，为揭示中医“气”实质提供了证据支撑。