小柴胡汤“去滓重煎”对LPS 诱导发热白兔模型体温及血清IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平的影响

兰 斌，张 钰，龙 睿，丑天舒*（湖南中医药大学，湖南 长沙410208）

小柴胡汤是临床用于治疗发热病症的经典方剂，但近年来常存在“病准方对药不灵”的情况，即辨证施治准确但临床疗效却不理想[1-2]。 正如李时珍[3]的《本草纲目》中云：“凡服汤药，虽品物专精，修治如法，而煎药者鲁莽造次，水火不良，火候失度，则药亦无功。 ”北宋医家沈括[4]在《良方》中论煎煮汤剂必“煮炼有节”，表明煎煮方法的正确选择能够确保经方的临床疗效。“去滓重煎”法首见于《伤寒论》中，是一类特殊的浓缩煎煮法，自汉末以来就被历代医家所认可，可使药液浓缩，减轻患者胃肠刺激[5-6]。 前期临床研究发现，运用小柴胡汤“水煎服”治疗临床发热的2829 例中，严格按照原文要求“去滓重煎”的仅29 例，约占总体的1%，而痊愈者占总数的49.13%，提示临床上不规范的煎煮方式可能导致药效作用的减弱甚至丧失[7-8]。 本课题通过观察小柴胡汤去滓重煎对脂多糖（lipopolysaccharides, LPS）诱导新西兰兔发热模型体温及血清中白细胞介素1β（interleukin-1β, IL-1β）、白细胞介素6（interleukin-6, IL-6）和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）水平的影响，探讨小柴胡汤“去滓重煎”治疗发热的作用机制，为临床解热提供新的治疗思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取健康新西兰兔50 只，雌雄各半，体质量（1.5±0.5） kg，由湖南太平生物科技有限公司提供，许可证号：SCXK（湘）2015-0004，动物质量合格证号：1107301911000138。 实验动物饲养于湖南中医药大学动物实验中心饲养室，室温（25±2） ℃，湿度45%～65%，许可证编号：SYXK（湘）2019-0009。 符合中华人民共和国科学技术部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》，并经湖南中医药大学医学实验动物伦理委员会审查和批准。

1.2 主要仪器与试剂

漩涡混匀仪（型号：MIX-25P，武汉华联科生物技术有限公司）；电子秤（武汉华联科生物技术有限公司）；肛温计（安徽方达药械有限公司）；EDTA 抗凝管（三力医用科技发展有限公司）；5 mL 普通试管（南京瑞崛仪器设备有限公司）。

IL-1β、IL-6 和TNF-α ELISA（批号：L150707213）均产自武汉优尔生科技有限公司，由上海朗顿生物技术有限公司提供。 LPS（Escherichca coli endotoxin 055：B5，美国Sigma 公司，批号1010A031）用无菌生理盐水溶解成2 μg·mL-1溶液。阿司匹林（拜耳医药保健有限公司，批号J20130078）用无菌生理盐水溶解成0.13 g·mL-1。 水合氯醛（国药集团化学试剂有限公司，批号20160113）用无菌生理盐水溶解成10%溶液。

1.3 中药材的选取与制备

小柴胡汤组成：北柴胡.24 g，青半夏9 g，黄芩9 g，人 参9 g，炙甘草6 g，生姜9 g 和大枣10 g，按照《中华人民共和国药典》（2015 版）药材标准，购自湖南中医药大学第一附属医院中药房。

小柴胡汤普通煎煮法制备药液：取小柴胡汤干燥饮片一剂，加入760 mL 水，浸泡40 min，大火煎煮至沸腾40 min 后，过滤并取药渣，将药渣同法再煎煮2 次，合并3 次药液，并将所得药液用双层纱布过滤，再煎取600 mL，生药浓度为0.13 g·mL-1。

小柴胡汤“去滓重煎”法制备药液：取小柴胡汤干燥饮片一剂，加入2 400 mL 水，煎煮至1 200 mL后滤掉药渣，将所得药液再煎煮至600 mL，生药浓度为0.13 g·mL-1。

1.4 动物分组及模型建立

选取50 只新西兰白兔在实验环境中喂养1 周（自由取食、饮水和光照等），再将其随机分为5 组：正常组、模型组、小柴胡汤原液组、小柴胡汤“去滓重煎”组和阿司匹林组，每组10 只。实验前，新西兰兔禁食、不禁水12 h。 正常组经耳缘静脉注射同等体积生理盐水，其余组动物以0.3 mL·kg-1剂量经耳缘静脉注射浓度为2 μg·mL-1的LPS 水溶液，完成发热模型建立。

1.5 动物给药处理

造模成功后，新西兰兔灌胃剂量按照“人与动物体表面积折算等效剂量”进行灌服给药。小柴胡汤原液组：按0.32 g·kg-1剂量灌服普通煎煮法所得的水煎液5 mL；小柴胡汤去滓重煎组：按0.32 g·kg-1剂量灌服“去滓重煎”法所得的水煎液5 mL；阿司匹林组：按0.32 g·kg-1剂量灌服阿司匹林水溶液5 mL；正常组与模型组灌服同等体积生理盐水5 mL；均早、晚灌服1 次。

1.6 指标检测

1.6.1 各组新西兰兔体温在不同时间点体温值 造模前，连续3 d 早、晚测量各组新西兰兔肛温（测温探头插入肛门4 cm）2 次，并取3 d 平均值作为新西兰兔的基础体温（T0）。 各组新西兰兔经灌服给药后，每隔0.5 h 监测新西兰兔肛温（T1），连续观测2 h，记录各组平均体温变化△T（△T =T1-T0）。

1.6.2 各组新西兰兔血清IL-1β、IL-6 和TNF-α 含量 经白兔耳缘静脉采血入5 mL 普通试管内，室温静置4 h， 以3 500 r/min 转速于4 ℃离心15 min，分离出血清后。再严格按ELISA 试剂盒内操作程序，运用ELISA 法检测新西兰兔血清IL-1β、IL-6和TNF-α 含量。

1.6.3 各组新西兰兔中白细胞和嗜中性粒细胞水平 测量最后1 次体温后，采用10%水合氯醛进行腹腔注射麻醉。经白兔耳缘静脉采血入EDTA 抗凝管中，轻轻摇晃使抗凝素与血液完全混合，再通过血细胞检测分析仪进行自动检测白细胞和中性粒细胞数量，并记录读数。

1.7 统计学处理方法

采用SPSS 22.0 统计软件进行统计学分析，各组数据均以“±s”表示，多组间数据经方差齐性检验后，两组间比较采用单因素方差分析，检验水平α=0.05，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组新西兰兔在不同时间点的体温值变化

与正常组比较，各组新西兰兔在造模30 min 后开始发热，皮肤温度逐渐升高（P＜0.05），结膜充血并出现发抖、蜷缩；1.5 h 后，各组新西兰兔体温明显上升（P＜0.01），皮温升高，呼吸急促，结膜充血严重，运动行为萎靡。与模型组比较，小柴胡汤原液组和小柴胡汤去滓重煎组在各时间点的症状都有明显改善以及体温下降（P＜0.05）；与小柴胡汤原液组比较，小柴胡汤去滓重煎组在1.5 h 和2 h 时间节点的体温低于小柴胡汤原液组（P＜0.05）。 见表1。

表1 各组新西兰兔注射LPS 后体温在不同时间点△T 值变化(℃，±s,n=10）

表1 各组新西兰兔注射LPS 后体温在不同时间点△T 值变化(℃，±s,n=10）

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与小柴胡汤原液组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

组别正常组模型组小柴胡汤原液组小柴胡汤去滓重煎组阿司匹林组F 值P 值30 min 0.24±0.07 0.80±0.38*0.37±0.29#0.31±0.37##0.77±0.23#235.418 0.000 1 h 0.24±0.09 0.84±0.21*0.68±0.39#0.72±0.34#0.78±0.21#199.445 0.012 1.5 h 0.23±0.10 1.48±0.34**1.05±0.29#0.63±0.31##△0.89±0.20##△217.613 0.000 2 h 0.24±0.09 0.81±0.21**0.72±0.32#0.35±0.54##△0.75±0.21#203.756 0.000

2.2 小柴胡汤“去滓重煎”对发热白兔血清IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平的影响

与正常组比较，模型组血清IL-1β、IL-6 和TNFα 含量均显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，小柴胡汤原液组和小柴胡汤去滓重煎组血清IL-1β、IL-6和TNF-α 含量均下降（P＜0.05 或P＜0.01）；与小柴胡汤原液组比较，小柴胡汤去滓重煎组血清IL-1β、IL-6 和TNF-α 含量低于小柴胡汤原液组（P＜0.05）。 见表2。

表2 小柴胡汤“去滓重煎”对发热白兔血清IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平的影响(±s,n=10,ng·L-1）

表2 小柴胡汤“去滓重煎”对发热白兔血清IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平的影响(±s,n=10,ng·L-1）

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与小柴胡汤原液组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

组别正常组模型组小柴胡汤原液组小柴胡汤去滓重煎组阿司匹林组F 值P 值IL-1β 11.33±3.89 36.44±9.23**24.98±3.97#16.80±2.24##△11.65±2.74##△△43.734 0.000 IL-6 36.63±10.2 131.36±21.22**100.71±12.50#63.83±11.29##△55.45±14.98##△△51.453 0.000 TNF-α 47.19±10.50 220.89±26.33**149.05±18.51#83.34±27.21##△69.56±20.08##△△131.794 0.000

2.3 各组新西兰兔中白细胞和嗜中性粒细胞变化

与正常组比较，模型组白细胞和嗜中性粒细胞数目均显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，小柴胡汤原液组和小柴胡汤去滓重煎组白细胞和嗜中性粒细胞数目均有所降低（P＜0.05 或P＜0.01）；与小柴胡汤原液组比较，小柴胡汤去滓重煎组白细胞和嗜中性粒细胞数目差异无统计学意义（P＞0.05）。 见表3。

表3 各组新西兰兔中白细胞和嗜中性粒细胞变化(±s,n=10）

表3 各组新西兰兔中白细胞和嗜中性粒细胞变化(±s,n=10）

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与小柴胡汤原液组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

组别正常组模型组小柴胡汤原液组小柴胡汤去滓重煎组阿司匹林组F 值P 值白细胞计数/（×109/L-1）16.8±1.11 21.19±1.23*7.73±4.18##7.94±4.48##12.76±8.52#15.601 0.026嗜中性粒细胞计数/（×109/L-1）4.00±0.70 9.51±4.02*5.66±4.00##6.53±3.82#10.83±8.00 15.850 0.027嗜中性粒细胞百分比/%51.05±3.87 77.19±7.50*75.00±4.30#80.91±4.82 80.86±11.87 20.772 0.328

3 讨论

发热是由于内、外致热源通过中枢发热介质作用于体温调节中枢，促使体温调定点上移而引起的调节性体温升高[9-10]。 LPS 作为革兰阴性细菌内毒素的活性成分，是诱导强发热的主要外源性致热源，通过作用于机体内巨噬细胞，促使其产生IL-1β、IL-6和TNF-α 等重要的炎性递质，从而引起机体的强烈炎症反应，促使体温升高[11-12]。 前期研究表明，在众多动物模型中，新西兰兔对内毒素的生物学反应与人类最为接近。在本实验研究中，我们选取新西兰兔作为实验对象，以0.6 μg·kg-1剂量经耳缘静脉注射浓度为2 μg·mL-1的LPS 建立新西兰兔发热模型。结果显示各组新西兰兔在造模30 min 后开始发热，皮肤温度逐渐升高，结膜充血并出现发抖、蜷缩；1.5 h后，各组新西兰兔体温明显上升，皮温升高，呼吸急促，结膜充血严重，运动行为萎靡，且模型组血清IL-1β、IL-6 和TNF-α 含量均显著升高，白细胞和嗜中性粒细胞数目均显著升高，提示模型建立成功。

小柴胡汤出自东汉张仲景《伤寒论》中“和”法的经典方，广泛用于临床治疗发热性病证。方中柴胡味辛微苦，气质薄且味稍轻，煎煮时常溶出且升散。 半夏性温味辛、气平微苦，可开结气，降逆气，消正邪之搏结。 黄芩可除少阳郁热，再配以生姜之辛温，以助柴胡、半夏枢转开结。加大枣、人参、炙甘草等味甘之类，以扶正达邪，并缓其温散之势，且制约黄芩苦寒伤正[13]。 “去滓重煎”法首见于《伤寒论》：“以水一斗二升，煮取六升，去滓，再煎取三升”，煎煮时，所需汤药之量更少，减少了对胃肠道的刺激，避免停饮致呕，能达到调和方中药性寒温之差，味苦辛甘之异，功用祛邪扶正之别[14-15]。 现代药理学研究发现，通过高效液相色谱法测定小柴胡汤“去滓重煎”法中黄芩的有效化学成分（如黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素等）含量明显高于不去滓煎法（P＜0.05），且溶液中柴胡皂苷a、b1、d 含量及抗炎效果明显优于传统“水煎服”法（P＜0.05）[16-17]。

本研究通过选取小柴胡汤干燥饮片，经“去滓重煎”后的浓缩液治疗LPS 诱导的新西兰兔发热模型。 结果发现小柴胡汤“去滓重煎”组新西兰兔血清IL-1β、IL-6 和TNF-α 含量低于小柴胡汤原液组；小柴胡汤原液和小柴胡汤去滓重煎液均能有效降低模型组白细胞和嗜中性粒细胞数目；但小柴胡汤去滓重煎组在1.5 h 和2 h 时间节点的体温明显低于小柴胡汤原液组，且解热效果更佳，可能主要与小柴胡汤“去滓重煎”液降低血清中IL-1β、IL-6 和TNF-α 含量有关；小柴胡汤“去滓重煎”时，汤液中有效成分并不增加，但继续煎煮过程中，药物属气、属阳的成分相对于属阴、属味的成分易偏于升散，更多地挥发而丢失，则味分之药物成分得到保存，既取药物之气，又留药物之味，使药物间阴阳调和，补泻相和，更好地发挥了和解少阳之功[18-19]。

本实验研究探讨了小柴胡汤“去滓重煎”的解热效果及血清中IL-1β、IL-6 和TNF-α 含量的影响，为临床应用小柴胡汤“去滓重煎”法治疗发热提供了一定的实验依据，无论是从理论基础，还是解热疗效，都说明了小柴胡汤“去滓重煎”法在临床应用中的潜在价值，但其机制仍需深入研究。